This article is about the bacteria (communities) that a biofilter requires in order to be able to reintroduce the fish excretions into the food cycle in an aquaponics system or in aquaculture. The necessary balance in the bacterial community is fragile and extremely complex. In the following compilation of scientific research results you will find studies about the biofilters (compositions) used in aquaponics and their interaction both with each other and with their environment. 

This article contains, among other things, excerpts and translations from studies by the School of Freshwater Sciences, University of Wisconsin-Milwaukee, USA. Authors and information about the sources used can be found at the end of this article . We assume no liability for the accuracy of the translation or the scientific statements or the conclusions drawn from them. According to fisheries experts from  LANUV  and the ministry, practical experience shows that new systems only produce around 10% - 30% of the maximum possible biomass in the first few years. In stable operation, recirculation systems are operated at approx. 70% - 80% of their capacity.

Recirculating aquaculture systems (RAS) are unique engineered ecosystems that minimize environmental disturbances by reducing the discharge of nutrient pollution. RAS typically use a biofilter to control ammonia levels, which are a byproduct of fish protein breakdown. 

Nitrosomonas  (ammonia oxidizing),  Nitrospira ,  and  Nitrobacter  (nitrite oxidizing) species are believed to be the primary nitrifiers present in RAS biofilters. We examined this claim by characterizing the biofilter bacterial and archaeal community of a commercial-scale freshwater RAS that has been in operation for >15 years. We found that the biofilter community harbored a diverse range of bacterial taxa (>1000 taxon assignments at the genus level),  dominated by Chitinophagaceae (~12%) and  Acidobacteria  (~9%). The bacterial community showed significant shifts in composition with changes in biofilter depth and associated with operational changes over a fish rearing cycle. Archaea  were also abundant and consisted exclusively of a   low diversity (>95%)  assemblage of Thaumarchaeota , which were considered ammonia-oxidizing archaea (AOA) due to the presence of AOA ammonia monooxygenase genes. Nitrosomonas  were present at all depths and at all times. However, their abundance was >3 orders of magnitude lower than AOA and showed significant depth-time variability not observed in AOA. Phylogenetic analysis of the nitrite oxidoreductase beta subunit (  nxrB  ) gene showed two distinct Nitrospira  populations were present, while  Nitrobacter  were not detected. Subsequent identification of  Nitrospira  ammonia monooxygenase alpha subunit genes coupled with phylogenetic placement and quantification of  nxrB  genotypes suggests that complete ammonia-oxidizing (comammox) and nitrite-oxidizing  Nitrospira  populations exist in this system with relatively equivalent and stable frequencies coexist. It appears that RAS biofilters harbor complex microbial communities whose composition can be directly influenced by typical system operation, while supporting multiple ammonia oxidation lifestyles within the nitrifying consortium.

introduction

The development of aquaculture technology allows societies to reduce dependence on capture fisheries and offset the effects of declining fish stocks (  Barange et al., 2014  ). Aquaculture production now accounts for almost 50% of fish produced for consumption, and it is estimated that a fivefold increase in production will be required over the next two decades to meet societal protein needs (FAO, 2014  )  . However, expanding production will increase the environmental impact of aquaculture facilities and raises important concerns about the sustainability of aquaculture practices. Recirculating aquaculture systems (RAS) were developed to overcome pollution problems and storage capacity limitations of conventional terrestrial aquaculture facilities (  Chen et al., 2006 ;  Martins et al., 2010  ). RAS offer several advantages over traditional flow-through systems, including: 90–99% less water consumption (  Verdegem et al., 2006  ;  Badiola et al., 2012  ), more efficient waste management (  Piedrahita, 2003  ), and potential for implementation at sites requiring distance to the market (  Martins et al., 2010  ). RAS components are similar to those used in wastewater treatment, including solids separation and nitrogenous waste removal from excess animal waste and undigested feed. The advancement of RAS technology and advantages over flow-through systems have led to increasing use of RAS, particularly in countries that place great emphasis on minimizing environmental impacts ( Badiola et al., 2012  ) and in urban areas where space is limited is (  Klinger and Naylor, 2012  ).

Nitrifying biofilters are a critical component of most RAS and an important factor in operational success. These biofilters are also cited as the biggest hurdle to RAS commissioning and the most difficult component to manage once the RAS is operational (  Badiola et al., 2012  ). RAS biofilters are designed to remove nitrogenous waste byproducts created by fish protein catabolism and oxidation processes. Ammonia and nitrite are of utmost importance to freshwater aquaculturists because the toxic dose of both types of nitrogen depends on the pH and the aquatic organism being reared (  Lewis and Morris, 1986  ;  Randall and Tsui, 2002  ). In RAS engineering, designers typically refer to the major nitrifying taxa as  Nitrosomonas spp. (ammonia oxidizers) and  Nitrobacter  spp. (nitrite oxidizers) (  Kuhn et al., 2010  ) and model system capacity from the physiologies of these organisms (  Timmons and Ebeling, 2013  ). It is now clear that  Nitrosomonas  and  Nitrobacter  are typically absent or present at low levels in freshwater nitrifying biofilters (  Hovanec and DeLong, 1996  ), while  Nitrospira  spp. are common (  Hovanec et al., 1998  ). Recent studies of biofilters in freshwater aquaculture have expanded the nitrifying taxa present in these systems to include ammonia-oxidizing archaea (AOA), a variety of  Nitrospira  spp. and  Nitrotoga expanded (  Sauder et al., 2011  ;  Bagchi et al., 2014  ;  Hüpeden et al., 2016  ). Further studies are required to understand whether other nitrifying consortia RAS biofilters together with  Nitrosomonas  and  Nitrobacter  spp. inhabit or whether diverse collections of nitrifying organisms are characteristic of highly functional systems. A more refined understanding of the physiology of RAS biofilter nitrification consortia would inform system design optimization and could change parameters now considered design constraints.

The non-nitrifying component of RAS biofilter communities also influences biofilter function. Heterotrophic biofilm overgrowth can limit oxygen availability to the autotrophic nitrifying community, resulting in reduced ammonia oxidation rates (  Okabe et al., 1995  ). Conversely, optimal heterotrophic biofilm formation protects the slower growing autotrophs from biofilm shear stress and recycles autotrophic biomass (  Kindaichi et al., 2004  ). Previous studies have shown that the diversity of non-nitrifying microorganisms in RAS biofilters could be high and could sometimes contain opportunistic pathogens and other commercially harmful organisms (  Schreier et al., 2010 ). However, most of these studies used low-coverage characterization methods (e.g. DGGE, clone libraries) to describe the taxa present, so the extent of this diversity and similarity between systems is relatively unknown. Recently, the bacterial community of a series of seawater RAS biofilters operated at different salinity and temperature combinations was characterized using massively parallel sequencing technology (  Lee et al., 2016  ). This study provided the first in-depth examination of a RAS biofilter microbial community, revealing a highly diverse bacterial community that changed in response to environmental conditions, but a more consistent nitrifying assemblage typically dominated by microorganisms of the Nitrospira classification  .

In this study, we aimed to characterize in depth the bacterial and archaeal community structure of a commercial freshwater RAS culture of  Perca flavescens  (yellow perch) using a vortex sand biofilter that has been in operation for more than 15 years. We hypothesized that the biofilter sand biofilm community would exhibit temporal variability associated with environmental changes associated with the animal rearing process and diverse nitrifying assemblage. To answer these questions, we used massively parallel sequencing to characterize the bacterial and archaeal biofilter community across depth and time gradients. We also identified and phylogenetically classified nitrification marker genes for the alpha subunit of ammonia monooxygenase (  amoA  ;  Rotthauwe et al., 1997) ; Pester et al., 2012  ; van Kessel et al., 2015  ) and nitrite oxidoreductase alpha (  nxrA  ;  Poly et al., 2008  ;  Wertz et al., 2008  ) and beta (  nxrB  ;  Pester et al., 2014  ) subunits present in the biofilter, and then tracks their frequency with biofilter depth and over the course of a fish rearing cycle.

Materials and methods

Description of the UWM biofilter

All samples were collected by the RAS biofilter (UWM biofilter) at the University of Wisconsin-Milwaukee Great Lakes Aquaculture Facility. Measured from the base, the biofilter is ~2.74 m high and ~1.83 m in diameter. The water level within the biofilter is ~2.64 m from the base, with the fluidized sand filter matrix extending to a height of Extends ~1.73 m from the base. The biofilter is filled with Wedron 510 silica sand, which is fluidized to ~200% starting sand volume through the use of 19 Plan 40 PVC probes, each 3.175 cm in diameter. The probes receive inflow from the solid waste clarifier, which rises through the filter matrix. Samples for this study were collected at three depths within the fluidized sand biofilter, defined as surface (~1.32–1.42 m from the biofilter base), middle (~0.81–0.91 m from the biofilter base), and bottom (~0.15–0.30 m, made from biofilter base). Images of the UWM biofilter and sampling locations are shown in Figure 1  . The maximum flow rate of the biofilter inflow is 757 L per minute, resulting in a hydraulic retention time of ~9.52 min. Typical system water quality parameters are as follows (mean ± standard deviation): pH 7.01 ± 0.09, oxidation-reduction potential 540 ± 50 (mV), water temperature 21.7 ± 0.9 (°C), and dissolved oxygen (DO) of biofilter effluent 8.20 ± 0.18 mg/l. The biofilter is designed for maximum operation at 10 kg of feed per day, which is based on predicted ammonia production from fish protein breakdown at this feeding rate (  Timmons and Ebeling, 2013  ).

FIGURE 1. ILLUSTRATION OF UW-MILWAUKEE'S RECYCLING AQUACULTURE SYSTEM (RAS) FLUID SAND BIOFILTER  . For illustrative purposes only a single inflow pipe is shown. Nineteen of these pipes are present in the system. Water flow is shown with directional arrows, sample locations are marked with circles, and biofilter elevation is listed.

 

Sample collection, processing and DNA extraction

Samples from the top of the biofilter matrix were collected in autoclaved 500 mL polypropylene bottles. Two samples from the surface of the biofilter were collected during the last 2 months of a yellow perch rearing cycle and then immediately before the start of a new rearing cycle in the system. After the system was stocked with fish, samples were collected approximately every week for the first half of the new rearing cycle (the yellow perch strains present during this study take approximately 9 months to grow to market size). After collection, water from the biofilter matrix samples was decanted into a second sterile 500 mL bottle for further processing. Then, approximately 1 g of wet weight sand was removed from the sample bottle and frozen at −80 °C for storage prior to DNA extraction. Water samples were filtered to 0. 22 μm filters (47 mm mixed cellulose esters, EMD Millipore, Darmstadt, Germany) frozen at −80 °C and macerated with a sterilized spatula before DNA extraction. To address the spatial distribution of bacterial taxa separately, depth samples were collected from the filter matrix using 50 ml syringes with attached weighted Tygon tubing (3.2 mm ID, 6.4 mm OD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie , France). Samples were categorized according to the approximate distance from the filter base as surface, center, and bottom. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA and macerated with a sterilized spatula before DNA extraction. To address the spatial distribution of bacterial taxa separately, depth samples were collected from the filter matrix using 50 ml syringes with attached weighted Tygon tubing (3.2 mm ID, 6.4 mm OD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie , France). Samples were categorized according to the approximate distance from the filter base as surface, center, and bottom. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA and macerated with a sterilized spatula before DNA extraction. To address the spatial distribution of bacterial taxa separately, depth samples were collected from the filter matrix using 50 ml syringes with attached weighted Tygon tubing (3.2 mm ID, 6.4 mm OD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie , France). Samples were categorized according to the approximate distance from the filter base as surface, center, and bottom. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA. Depth samples were extracted from the filter matrix using 50 mL syringes with attached weighted Tygon tubing (3.2 mm ID, 6.4 mm OD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, France). Samples were categorized according to the approximate distance from the filter base as surface, center, and bottom. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA. Depth samples were extracted from the filter matrix using 50 mL syringes with attached weighted Tygon tubing (3.2 mm ID, 6.4 mm OD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, France). Samples were categorized according to the approximate distance from the filter base as surface, center, and bottom. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA 4mm OD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, France). Samples were categorized according to the approximate distance from the filter base as surface, center, and bottom. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA 4mm OD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, France). Samples were categorized according to the approximate distance from the filter base as surface, center, and bottom. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA. The tubing was sterilized with 10% bleach and rinsed three times with sterile deionized water between samplings. DNA was extracted separately from biofilter sand and water samples (~1 g wet weight and 100 mL, respectively) using the MP Bio FastDNA^®  SPIN Kit for Soil (MP Bio, Solon, OH, USA) according to the manufacturer's instructions, except that each sample was beaten for 2 minutes with the beads included in the MP Bio FastDNA ® SPIN Kit at the single operating speed of the Mini-BeadBeater  ^-  16 (Biospec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA). DNA quality and concentration were checked using a NanoDrop  ^®  Lite (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Sample details and associated environmental data and molecular analyzes are presented in Table S1.

 

Ammonia and nitrite measurements

For both the time series and depth profiles, a Seal Analytical AA3 Autoanalyzer (Seal Analytical Inc., Mequon, WI, USA) was used to quantify ammonia and nitrite using the manufacturer-supplied phenol and sulfanilamide protocols on two separate channels became. To quantify nitrite only, the cadmium reduction column was not installed in the Auto Analyzer. RAS operators recorded all other chemical parameters from submerged probes that measured temperature, pH and oxidation-reduction potential. Following laboratory standard operating procedures, RAS operators used Hach colorimetric kits to measure ammonia and nitrite concentrations in the rearing tank.

 

16S rRNA gene sequencing

To maximize read depth for a temporal study of biofilter surface communities, we used the Illumina HiSeq platform and separately targeted the V6 region of the 16S rRNA gene for  archaea  and  bacteria  . In total, we received community data from 15 dates for temporal analysis. To interrogate changes in the spatial distribution of taxa across depth in the biofilter and obtain increased taxonomic resolution, we used 16S rRNA gene V4-V5 region sequencing on an Illumina MiSeq. We obtained samples from three depths  n  = 5 for the surface,  n  = 5 for the middle and  n = 4 for the bottom. Example metadata is listed in Table S1. Extracted DNA samples were sent to the Josephine Bay Paul Center at the Marine Biological Laboratory (V6  Archaea  and V6  Bacteria  ; V4-V5 samples from 12/8/2014 to 2/18/2015) and to the Great Lakes Genomic Center (V4-V5 samples from 11/18 .2014, 12/2/2014, 12/18/2014) for massively parallel 16S rRNA gene sequencing using previously published bacterial (  Eren et al., 2013  ) and archaeal (  Meyer et al., 2013  ) V6 Illumina HiSeq and bacterial V4 V5 Illumina MiSeq chemistry (  Huse et al., 2014b  ;  Nelson et al., 2014 ). Reaction conditions and primers for all Illumina runs are listed in the citations above and can be accessed at: https://vamps.mbl.edu/resources/primers.php#illumina. Sequence run processing and quality control for the V6 data set are in  Fisher et al. (2015)  , while CutAdapt was used to trim the V4-V5 data from low quality nucleotides (phred score <20) and primers (  Martin, 2011  ;  Fisher et al., 2015  ). Trimmed reads were merged using Illumina Utils as described previously (  Newton et al., 2015  ). Minimum Entropy Decomposition (MED) was implemented for each dataset to group sequences (MED nodes = operational taxonomic units, OTUs) for sample community composition and diversity analysis ( Eren et al., 2015  ). MED uses the information uncertainty calculated via Shannon entropy at all nucleotide positions of an alignment to divide sequences into sequence-like groups (  Eren et al., 2015  ). The sequence datasets were parsed with the following minimum substantial abundance settings: Bacteria V6, 377; archaeal V6, 123; bacterial V4-V5, 21. The minimum substantial threshold sets the abundance threshold for inclusion of MED nodes (i.e. OTU) in the final data set. Minimum substantial frequencies were calculated by dividing the total number of 16S rRNA gene sequences per data set by 50,000 as suggested in MED Best Practices (sequence counts are listed in Table S2). The Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST) algorithm was used to assign a taxonomy to sequence reads ( Huse et al., 2008  ) and the Visualization and Analysis of Microbial Population Structures (VAMPS;  Huse et al., 2014a  ) website was used for uses data visualization.

 

Comammox  -amoA-  PCR

To target comammox  Nitrospira amoA  for PCR and subsequent cloning and sequencing,  amoA  nucleotide sequences were obtained from  van Kessel et al. (2015)  and  Daims et al. (2015)  were aligned with MUSCLE (  Edgar, 2004  ). The alignment was imported into EMBOSS to   generate  an amoA consensus sequence ( Rice et al., 2000  ). Primer sequences were identified from consensus using Primer3Plus (Untergasser et al., 2012)  ,  and  the candidates along with those described by  van Kessel et al. (2015), were evaluated from the consensus sequence in SeqMan Pro (DNAStar) using MUSCLE (  Edgar, 2004  ). The  pmoA  forward primer (  Luesken et al., 2011  ) and the candidate primer COM_amoA_1R (this study; Table  1  ) provided the best combination of read length and specificity and were subsequently used to   amplify amoA genes from our samples.

 

TABLE 1. PRIMER SETS USED FOR ENDPOINT PCR AND QPCR.

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Construction of a clone library and phylogenetic analysis

Multiple endpoint PCR approaches were used to   examine the nitrifying community composition of the RAS fluidized sand biofilter for amoA  (  Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria, Archaea,  and Comammox  Nitrospira  ),  nxrA  (  Nitrobacter  spp.), and  nxrB  (Non-  Nitrobacter NOB). The primer sets and reaction conditions used are   listed in Table 1 . All endpoint PCR reactions were performed with a volume of 25 μl: 12.5 μl 2x Qiagen PCR master mix (Qiagen, Hilden, Germany), 1.5 μl appropriate primer mix (F&R), 0.5 μl bovine serum albumin ( BSA), 0.75 μl 50 mM MgCl  ₂  and 1 μl DNA extract.

DNA samples of biofilter water and sand from four different time points of the rearing cycle were used to create clone libraries of  archaeal amoA  and  Nitrospira  sp. nxrB  .  A sample from the middle of the sand biofilter was used to construct clone libraries for Betaproteobacteria  -amoA  and Comammox  -amoA . The middle biofilter sample was selected because it produced well-defined amplicons suitable for cloning target  amoA genes. All PCR reactions for cloning libraries were constructed using a TOPO-PCR 2.1 TA cloning kit plasmid (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA). Libraries were sequenced on an ABI 3730 Sanger sequencer with M13 forward primers. Vector plasmid sequence contamination was removed using DNAStar (Lasergene Software, Madison, WI).

Cloned sequences of  Betaproteobacteria amoA, Archaea amoA,  and  Nitrospira nxrB  from this study were added to ARB alignment databases from previous studies (  Abell et al., 2012  ;  Pester et al., 2012  ,  2014  ). Comammox  -amoA  sequences from this study were compared with those from  van Kessel et al. matched. (2015)  ,  Pinto et al. (2015)  and  Daims et al. (2015)  using MUSCLE and imported into a new ARB database where the alignment was heuristically corrected prior to phylogenetic tree reconstruction. For the AOA, AOB and  Nitrospira amoA phylogenies, relationships were determined using maximum likelihood (ML) with RAxML on the Cipres Science Gateway (  Miller et al., 2010  ;  Stamatakis, 2014  ) and Bayesian inference (BI). calculated by MrBayes with a significant posterior probability of <0.01 and the associated consensus tree (  Abell et al., 2012  ;  Pester et al., 2012  ,  2014  ) integrated by ARB into a tree block within the input nexus file to reduce the calculation time (  Miller et al., 2010  ;  Ronquist et al., 2012  ). Consensus trees were then calculated from the ML and BI reconstructions using ARB's consensus tree algorithm (  Ludwig et al., 2004  ).

The  Nitrospira nxrB  sequences generated in this study were significantly shorter than those used for the  nxrB phylogenetic  reconstruction in  Pester et al. (2014)  , therefore we did not perform phylogenetic reconstructions as with the other marker genes. Instead, the UWM Biofilter and  Candidatus  Nitrospira nitrificans sequences were added to the majority consensus tree by  Pester et al. (2014)  using the quick-add parsimony tool of the ARB package (  Ludwig et al., 2004  ). This tool uses sequence similarity to add sequences to pre-existing trees without changing the tree topology.

 

qPCR assays for target marker genes

Quantitative PCR assays were developed to   distinguish two Nitrospira nxrB  genotypes and two  Nitrosomonas amoA genotypes in our system. Potential qPCR primer sequences were identified using Primer3Plus (  Untergasser et al., 2012  ) on MUSCLE (  Edgar, 2004 ) generated alignments in DNAStar (Lasergene Software, Madison, WI). Primer concentrations and annealing temperatures were optimized for specificity for each reaction target. Primers were checked using Primer-BLAST on NCBI to ensure assays matched their target genes. The newly designed primers were tested for cross-reactivity between genotypes using the non-target genotype sequence in both endpoint and real-time PCR dilution series. After optimization, all assays amplified only the target genotype. Due to the high sequence similarity between the two  archaeal amoA  genotypes (>90% identity) in our system, a single qPCR assay was developed to target both genotypes using the steps described above. The two closely related sequence types were pooled in equimolar amounts for reaction standards. A Komammox amoA  qPCR primer set was developed using the same methods as the other assays presented in this study. All test conditions are listed in Table  1  . All qPCR assays were performed on an Applied Biosystems StepOne Plus thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA).  Cloned target genes were used to generate standard curves from 1.5 × 10  ^{6 to 15 copies per reaction.} All reactions were performed in triplicate, with melting curve and endpoint confirmation of the assays (qPCR standard curve parameters and efficiency are listed in Table S3).

 

Statistics and data analysis

Taxonomy-based data were visualized with heatmaps created in the R statistical language (  R Core Team, 2014  ) by implementing functions from the gplots, Heatplus from Bioconductor Lite, VEGAN, and RColorBrewer libraries. MED nodes were used in all sample diversity metrics. The EnvFit function in the VEGAN (  Oksanen et al., 2015  ) R package was used to test the relationship between RAS observation data and changes in biofilter bacterial community composition. Pearson's correlations were calculated using the Hmisc package in R (  Harrell, 2016  ) to test whether 16S rRNA,  amoA  and  nxrB  gene copies were correlated over time. Kruskal-Wallis rank sum tests were performed in the R basic statistics package ( R Core Team, 2014  ) to test whether the populations of the above genes were stratified by depth. VEGAN's ADONIS function was used on the V4-V5 depth dataset to test the significance of the observed Bray-Curtis dissimilarity as a function of the categorical factors of depth, with strata = ZERO because the same biofilter was sampled multiple times.

 

Biomass model

To determine whether the observed ammonia removal could provide the energy required to support the number of potential ammonia-oxidizing microorganisms (AOM) in the biofilter as quantified via qPCR, we included the steady-state biomass concentration from the measured ammonia oxidation modeled by the following equation:

: 

 X  _AO  is  defined in previous models (Mußmann et al., 2011) as the biomass concentration of ammonia oxidizers in milligrams per liter, but in this study we converted to cells per wet gram of sand by finding the mean grams of sand per liter of water in Biofilter. Θ  _x  is the mean cell residence time (MCRT) in days and was unknown for the system. Θ is the hydraulic residence time in days, which in this system is ~9.52 min or 0.0066 days. Y  _AO  is the growth yield of ammonia oxidizers and  b  _AO  is the endogenous respiration constant of ammonia oxidizers, which  ^{were estimated to be 0.34 kg volatile suspended solids (VSS)/kg NH4 +}  -N and 0.15 d  -1 by  Mußmann et al. (2011)  . Δ  S  _NH  3  is the change in substrate ammonia concentration between inlet and outlet in mg/l. To  calculate  _{_}  _  _  _  _  _ *C/μm  ³  (  Mußmann et al., 2011  ) to relate the biovolume to endogenous respiration. The modeled biomass concentration was plotted against a range of potential MCRT for a RAS fluidized sand filter (Summerfelt, personal communication). The results of all amoA  qPCR assays were combined to estimate total ammonia-oxidizing microorganism biomass in copy numbers per gram wet weight of sand. The modeled biomass was then compared to our AOM qPCR assay results. A commented R script for the model is available on GitHub ( https://github.com/rbartelme/BFprojectCode.git  ).

 

NCBI sequence accession numbers

Bacterial V6, V4-V5, and archaeal V6-16S rRNA gene sequences generated in this study are available from the NCBI SRA (SRP076497; SRP076495; SRP076492). Partial gene sequences for amoA and nxrB are available through NCBI Genbank and have accession numbers KX024777–KX024822. Results Biofilter chemistry results RAS operational data were examined from the beginning of a yellow perch rearing cycle to approximately 6 months thereafter. The mean biofilter influent concentrations of ammonia and nitrite were 9.02 ± 4.76 and 1.69 ± 1.46 μM, respectively. Biofilter wastewater ammonia concentrations (3.84 ± 7.32 μM) remained within the toxicological limitations (

< 60 μM) of P. flavescens grown in the system. Occasionally, nitrite accumulated above the recommended threshold of 0.2 μM in both the rearing tank (0.43 ± 0.43 μM) and the biofilter effluent (0.73 ± 0.49 μM). No major fish diseases were reported during the RAS's operational period. Environmental and operational data are listed in Table S1. Bacteria and archaea accumulations within the biofilter Characterization of the RAS biofilter bacterial community showed that both the sand-associated and aquatic communities were diverse at a broad taxonomic level; Seventeen phyla averaged >

0.1% in each of the biofilter sand and water bacterial communities (see Table S2 for an example taxonomic characterization of the genus). Proteobacteria (on average 40% of biofilter sand community sequences and 40% of water sequences) and Bacteroidetes (18% in sand, 33% in water) dominated both water and sand bacterial communities. In taxonomic classification at the family level, the community associated with biofilter sand was different from the aquatic community. The majority of sequences in the sand samples were assigned to the bacterial groups Chitinophagaceae (average relative abundance 12%), Acidobacteria family unknown (9%), Rhizobiales family unknown (6%), Nocardioidaceae (4%), Spartobacteria family unknown ( 4%) and Xanthomonadales - family unknown (4%). Water samples were dominated by sequences classified as Chitinophagaceae (14%), Cytophagaceae (8%), Neisseriaceae (8%), and Flavobacteriaceae (7%). At the genus level , Kribbella, Chthoniobacter, Niabella, and Chitinophaga were the most numerous taxa classified, each with an average of >3% relative abundance in the biofilter samples. Using Minimum Entropy Decomposition (MED) to obtain highly discriminatory sequence classification, we identified 1261 nodes (OTUs) in the entire bacterial dataset. A MED-based comparison of bacterial community composition (Figure 1 ) supported the patterns observed using a broader taxonomic classification, indicating that the biofilter sand-associated community was distinct from the assemblage present in the biofilter water. In contrast to the high diversity in the bacterial community, we found that the archaeal community is dominated by a single taxonomic group belonging to the genus Nitrososphaera This taxon accounted for >99.9% of the Archaea -classified sequences identified in the biofilter samples (Table S2). This taxon was also almost entirely represented by a single sequence (>95% of sequences classified as Archaea ) that was identical to a number of Thaumarchaeota sequences deposited in the database, including the complete genome of Candidatus Nitrosocosmicus oleophilus (CP012850), together with clones from activated sewage sludge, wastewater treatment and freshwater aquariums (KR233006, KP027212, KJ810532–KJ810533). Initial characterization of the biofilter community composition revealed distinct communities between the biofilter sand and decanted biofilter water (Figure 2 ). Based on these data and the fact that fluidized bed biofilter nitrification occurs primarily in particle-bound biofilms ( Schreier et al., 2010 ), we focused our further analyzes on the biofilter sand matrix. In the sand samples, we observed a significant change in bacterial community composition (MED nodes) over time (Table 2 ). The early part of the study, which included a period when market size yellow perch were present in the system (sample −69 and −26), a fallow period after fish removal (sample 0), and the period after restocking of mixed juveniles (Samples 7 and 14) had a more variable bacterial community composition (mean Bray-Curtis similarity 65.2 ± 6.5%) than the remaining samples ( n = 9), which were collected at time points after an adult food source had been started (20.0 ± 6.4%, Figure 3 ). Several operational and measured physical and chemical parameters, including oxidation-reduction potential, feed size, conductivity, and nitrite from the biofilter, were correlated ( S < 0.05) with the time-dependent changes in bacterial community composition (see Table 2 for environmental correlation results).

 

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	FIGURE 2. DENDROGRAM ILLUSTRATING THE BACTERIAL COMMUNITY COMPOSITIONAL RELATIONSHIPS BETWEEN BIOFILTER SAND AND BIOFILTER WATER SAMPLES. A complete linkage dendrogram is represented using Bray-Curtis sample dissimilarity relationships based on nodal distributions of minimum entropy decomposition between samples (V6 dataset). The leaves of the dendrogram are labeled with the day count, with 0 representing the start of a fish rearing cycle. Negative numbers are days before a new breeding cycle. The day count is followed by the date of sampling (MM.DD.YY). See Table S1 for example metadata.
	TABLE 2. CORRELATIONS BETWEEN ENVIRONMENTAL VARIABLES AND BACTERIAL COMMUNITY COMPOSITION.
	FIGURE 3. NON-METRIC MULTIDIMENSIONAL SCALING DIAGRAM OF BRAY-CURTIS BACTERIAL COMMUNITY COMPOSITION DISsimilarity BETWEEN SAMPLING POINTS. nMDS stress = 0.07 and dimensions (k) = 2. Arrows show the progression of the sample through time from the end of a rearing cycle (day number -69 and -26) to a period without fish (0) and into the subsequent rearing cycle ( 7-126). The circle shows samples taken after the fish had grown to a size where feed type and amount were stabilized (3 mm pelleted feed and 3-7 kg feed per day).
Using a second sequence data set (V4-V5 16S rRNA gene sequences), we examined sand-associated bacterial community composition across a depth gradient (surface, middle, bottom). We found that the bacterial communities in the top sand samples were different from those in the middle and bottom (ADONIS  R  2  = 0.74,  p  = 0.001; Figure  4  ). The  planctomycetes  represented a larger proportion of the community in the surface sand (on average 15.6% of the surface sand versus 9.6% of the middle/lower sand), while the middle and lower layers harbored a larger proportion of  Chitinophagaceae  (7.4% in the surface sand vs. 16.8% middle/bottom) and  Sphingomonadaceae (2.4% in the surface vs. 7.9% in the middle/bottom; Figure  4  ).
	FIGURE 4. DEPTH COMPARISON OF BACTERIAL BIOFILTER COMMUNITY COMPOSITION. A heatmap is presented for all bacterial families with a relative abundance of ≥ 1% in each sample. Relative taxon abundance was generated from V4–V5 16S rRNA gene sequencing and is presented on a scale of 0 to 25%. The dendrogram represents the Bray-Curtis dissimilarity between sample community composition. Sample IDs are listed and sample depth is indicated by on the graph next to the dendrogram. Sample names correspond to sample metadata in Table S1.

 

Nitrification community composition and phylogeny

The massively parallel 16S rRNA gene sequencing data showed that bacterial taxa not associated with nitrification comprised the majority (~92%) of the sand biofilter bacterial community. In contrast, >99.9% of archaeal 16S rRNA gene sequences were assigned to a single taxon associated with known AOA. Among bacterial taxa, Nitrosomonas represented 1% of the total community in all samples, and no Nitrobacter sequences were obtained. We were also unable to amplify Nitrobacter nxrA genes (Figure S1) with a commonly used primer set ( Poly et al., 2008 ; Wertz et al., 2008 ). In contrast, Nitrospira was quite abundant, accounting for 2–5% of the total bacterial community (Table S2).

 

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Context: 

 

ID: 425

 

In diesem Artikel geht es um die Bakterien (-Gemeinschaften) die ein Biofilter benötigt um in einer Aquaponikanlage oder in einer Aquakultur die Ausscheidungen der Fische wieder in den Nahrungskreislauf mit einbringen zu können. Das dafür nötige Gleichgewicht in der Bakteriengemeinschaft ist fragil und besitzt eine enorme Komplexität. In der folgenden Zusammenstellung wissenschaftlicher Forschungsergebnisse finden Sie Untersuchungen über die in der Aquaponik verwendete Biofilter (-Zusammensetzungen) und ihre Interaktion sowohl untereinander als auch mit ihrer Umwelt. 

Dieser Artikel enthält unter anderem Auszüge und Übersetzungen aus Studien der School of Freshwater Sciences, University of Wisconsin-Milwaukee, USA. Urheber und Hinweise zu den verwendeten Quellen finden Sie am Ende dieses Artikels. Wir übernehmen keine Gewähr für die Richtigkeit der Übersetzung oder der wissenschaftlichen Stellungnahmen sowie die Rückschlüsse daraus. Nach Aussagen von Fischerei-Experten des LANUV ⁽¹ und des Ministeriums gehen die Erfahrungen aus der Praxis dahin, dass neue Anlagen in den ersten Jahren nur ca. 10% - 30% der maximal möglichen Biomasse produzieren. Im stabilen Betrieb werden Kreislaufanlagen bei ca. 70% - 80% ihrer Kapazität betrieben.

¹⁾ Perspektivstudie Aquakultur-LANG.pdf

Rezirkulierende Aquakultursysteme (RAS) sind einzigartige technische Ökosysteme, die Umweltstörungen minimieren, indem sie die Einleitung von Nährstoffverschmutzungen reduzieren. RAS verwenden typischerweise einen Biofilter, um den Ammoniakgehalt zu kontrollieren, der als Nebenprodukt des Fischproteinabbaus entsteht. 

Es wird angenommen, dass Nitrosomonas (Ammoniak oxidierend), Nitrospira und Nitrobacter (Nitrit oxidierend) Arten die primären Nitrifikanten sind, die in RAS-Biofiltern vorhanden sind. Wir haben diese Behauptung untersucht, indem wir die Biofilter-Bakterien- und Archaeengemeinschaft eines Süßwasser-RAS im kommerziellen Maßstab charakterisiert haben, das seit > 15 Jahren in Betrieb ist. Wir fanden heraus, dass die Biofilter-Gemeinschaft eine Vielzahl von Bakterientaxa beherbergte (>1000 Taxonzuordnungen auf Gattungsebene), die von Chitinophagaceae dominiert wurden(~12 %) und Acidobakterien (~9 %). Die Bakteriengemeinschaft zeigte signifikante Verschiebungen der Zusammensetzung bei Änderungen der Biofiltertiefe und in Verbindung mit betrieblichen Änderungen über einen Fischaufzuchtzyklus. Archaea waren ebenfalls reichlich vorhanden und bestanden ausschließlich aus einer Ansammlung von Thaumarchaeota mit geringer Diversität (> 95%), die aufgrund der Anwesenheit von AOA-Ammoniak-Monooxygenase-Genen als ammoniakoxidierende Archaea (AOA) angesehen wurden. Nitrosomonas waren in allen Tiefen und zu allen Zeitpunkten präsent. Ihre Häufigkeit war jedoch > 3 Größenordnungen geringer als bei AOA und zeigte eine signifikante Tiefen-Zeit-Variabilität, die bei AOA nicht beobachtet wurde. Die phylogenetische Analyse des Gens der Nitrit-Oxidoreduktase-Beta-Untereinheit ( nxrB ) zeigte zwei verschiedeneNitrospira- Populationen waren vorhanden, während Nitrobacter nicht nachgewiesen wurden. Die anschließende Identifizierung der Gene der Nitrospira - Ammoniakmonooxygenase-Alpha-Untereinheit in Verbindung mit der phylogenetischen Platzierung und Quantifizierung der nxrB -Genotypen legt nahe, dass in diesem System vollständige Ammoniak-oxidierende (Comammox) und Nitrit-oxidierende Nitrospira -Populationen mit relativ äquivalenten und stabilen Häufigkeiten koexistieren. Es scheint, dass RAS-Biofilter komplexe mikrobielle Gemeinschaften beherbergen, deren Zusammensetzung direkt durch den typischen Systembetrieb beeinflusst werden kann, während sie mehrere Ammoniak-Oxidationslebensstile innerhalb des nitrifizierenden Konsortiums unterstützen.

Einführung

Die Entwicklung der Aquakulturtechnologie ermöglicht es Gesellschaften, die Abhängigkeit von Fangfischereien zu verringern und die Auswirkungen sinkender Fischbestände auszugleichen ( Barange et al., 2014 ). Die Aquakulturproduktion macht heute fast 50 % des für den Verzehr produzierten Fisches aus, und Schätzungen zufolge wird in den nächsten zwei Jahrzehnten eine Verfünffachung der Produktion erforderlich sein, um den gesellschaftlichen Proteinbedarf zu decken ( FAO, 2014 ). Die Ausweitung der Produktion wird jedoch die Umweltauswirkungen von Aquakulturanlagen erhöhen und wirft wichtige Bedenken hinsichtlich der Nachhaltigkeit von Aquakulturpraktiken auf. Rezirkulierende Aquakultursysteme (RAS) wurden entwickelt, um Verschmutzungsprobleme und Lagerkapazitätsgrenzen konventioneller terrestrischer Aquakulturanlagen zu überwinden ( Chen et al., 2006; Martins et al., 2010 ). RAS bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Durchflusssystemen, darunter: 90–99 % weniger Wasserverbrauch ( Verdegem et al., 2006 ; Badiola et al., 2012 ), effizienteres Abfallmanagement ( Piedrahita, 2003 ) und Potenzial für die Implementierung bei Standorte, die die Entfernung zum Markt verringern ( Martins et al., 2010 ). RAS-Komponenten ähneln denen, die in der Abwasserbehandlung verwendet werden, einschließlich Feststoffabscheidung und Entfernung von stickstoffhaltigen Abfällen aus überschüssigen tierischen Abfällen und unverdautem Futter. Der Fortschritt der RAS-Technologie und die Vorteile gegenüber Durchflusssystemen haben zu einer zunehmenden Verwendung von RAS geführt, insbesondere in Ländern, die großen Wert auf die Minimierung von Umweltauswirkungen legen (Badiola et al., 2012 ) und in städtischen Gebieten, wo der Platz begrenzt ist ( Klinger und Naylor, 2012 ).

Nitrifizierende Biofilter sind eine entscheidende Komponente der meisten RAS und ein wichtiger Faktor für den Betriebserfolg. Diese Biofilter werden auch als die größte Hürde für die Inbetriebnahme von RAS und die am schwierigsten zu verwaltende Komponente genannt, sobald das RAS in Betrieb ist ( Badiola et al., 2012 ). RAS-Biofilter dienen dazu, stickstoffhaltige Abfallnebenprodukte zu entfernen, die durch Fischproteinkatabolismus und Oxidationsprozesse entstehen. Ammoniak und Nitrit sind für Süßwasser-Aquakulturisten von größter Bedeutung, da die toxische Dosis beider Stickstoffarten vom pH-Wert und dem aufgezogenen Wasserorganismus abhängt ( Lewis und Morris, 1986 ; Randall und Tsui, 2002 ). In der RAS-Verfahrenstechnik nennen Konstrukteure die wichtigsten nitrifizierenden Taxa normalerweise als Nitrosomonasspp. (Ammoniakoxidierer) und Nitrobacter spp. (Nitritoxidierer) ( Kuhn et al., 2010 ) und Modellsystemkapazität aus den Physiologien dieser Organismen ( Timmons und Ebeling, 2013 ). Es ist jetzt klar, dass Nitrosomonas und Nitrobacter typischerweise in nitrifizierenden Biofiltern von Süßwasser fehlen oder in geringer Menge vorhanden sind ( Hovanec und DeLong, 1996 ), während Nitrospira spp. sind üblich ( Hovanec et al., 1998 ). Neuere Studien zu Biofiltern in Süßwasser-Aquakulturen haben die in diesen Systemen vorhandenen nitrifizierenden Taxa um Ammoniak-oxidierende Archaea (AOA), eine Vielzahl von Nitrospira spp. und Nitrotoga erweitert( Sauder et al., 2011 ; Bagchi et al., 2014 ; Hüpeden et al., 2016 ). Weitere Studien sind erforderlich, um zu verstehen, ob andere nitrifizierende Konsortien RAS-Biofilter gemeinsam mit Nitrosomonas und Nitrobacter spp. bewohnen oder ob vielfältige Ansammlungen von nitrifizierenden Organismen charakteristisch für hochfunktionale Systeme sind. Ein verfeinertes Verständnis der Physiologie der Nitrifikationskonsortien von RAS-Biofiltern würde die Optimierung des Systemdesigns beeinflussen und könnte Parameter ändern, die jetzt als Designeinschränkungen gelten.

Die nicht nitrifizierende Komponente von RAS-Biofiltergemeinschaften beeinflusst auch die Biofilterfunktion. Das Überwachsen von heterotrophem Biofilm kann die Sauerstoffverfügbarkeit für die autotrophe nitrifizierende Gemeinschaft einschränken, was zu verringerten Ammoniakoxidationsraten führt ( Okabe et al., 1995 ). Umgekehrt schützt eine optimale heterotrophe Biofilmbildung die langsamer wachsenden Autotrophen vor Biofilm-Scherstress und recycelt autotrophe Biomasse ( Kindaichi et al., 2004 ). Frühere Studien haben gezeigt, dass die Diversität nicht-nitrifizierender Mikroorganismen in RAS-Biofiltern groß sein könnte und manchmal opportunistische Krankheitserreger und andere kommerziell schädliche Organismen enthalten könnte ( Schreier et al., 2010). Die meisten dieser Studien verwendeten jedoch Charakterisierungsmethoden mit geringer Abdeckung (z. B. DGGE, Klonbibliotheken), um die vorhandenen Taxa zu beschreiben, sodass das Ausmaß dieser Vielfalt und Ähnlichkeit zwischen Systemen relativ unbekannt ist. Kürzlich wurde die Bakteriengemeinschaft einer Reihe von Meerwasser-RAS-Biofiltern, die mit unterschiedlichen Salinitäts- und Temperaturkombinationen betrieben wurden, mit massiv paralleler Sequenzierungstechnologie charakterisiert ( Lee et al., 2016 ). Diese Studie lieferte die erste eingehendere Untersuchung einer mikrobiellen Gemeinschaft eines RAS-Biofilters und enthüllte eine sehr vielfältige Bakteriengemeinschaft, die sich als Reaktion auf Umweltbedingungen veränderte, aber eine konsistentere nitrifizierende Ansammlung, die typischerweise von Mikroorganismen der Nitrospira -Klassifizierung dominiert wird.

In dieser Studie wollten wir die bakterielle und archaeale Gemeinschaftsstruktur einer kommerziellen Süßwasser-RAS-Züchtung von Perca flavescens (Gelber Barsch) unter Verwendung eines Wirbelsand-Biofilters, der seit mehr als 15 Jahren in Betrieb ist, eingehend charakterisieren. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Biofiltersand-Biofilmgemeinschaft eine zeitliche Variabilität aufweisen würde, die mit Umweltveränderungen verbunden ist, die mit dem Tieraufzuchtprozess und einer vielfältigen nitrifizierenden Ansammlung verbunden sind. Um diese Fragen zu beantworten, haben wir eine massiv parallele Sequenzierung verwendet, um die bakterielle und archaeale Biofiltergemeinschaft über Tiefen- und Zeitgradienten hinweg zu charakterisieren. Wir haben auch Nitrifikationsmarkergene für die Alpha-Untereinheit der Ammoniak-Monooxygenase ( amoA ; Rotthauwe et al., 1997) identifiziert und phylogenetisch klassifiziert; Pesteret al., 2012 ; van Kessel et al., 2015 ) und Nitritoxidoreduktase Alpha ( nxrA ; Poly et al., 2008 ; Wertz et al., 2008 ) und Beta ( nxrB ; Pester et al., 2014 ) Untereinheiten, die im Biofilter vorhanden sind, und dann verfolgt ihre Häufigkeit mit der Biofiltertiefe und im Laufe eines Fischaufzuchtzyklus.

Materialen und Methoden

Beschreibung des UWM-Biofilters

Alle Proben wurden vom RAS-Biofilter (UWM-Biofilter) der Great Lakes Aquaculture Facility der University of Wisconsin-Milwaukee gesammelt. Von der Basis aus gemessen ist der Biofilter ~2,74 m hoch und hat einen Durchmesser von ~1,83 m. Der Wasserspiegel innerhalb des Biofilters beträgt ~2,64 m von der Basis, wobei sich die fluidisierte Sandfiltermatrix bis zu einer Höhe von ~1,73 m von der Basis erstreckt. Der Biofilter ist mit Wedron 510-Quarzsand gefüllt, der durch die Verwendung von 19 Plan-40-PVC-Sonden mit jeweils einem Durchmesser von 3,175 cm auf ~200 % Ausgangssandvolumen fluidisiert wird. Die Sonden erhalten Zufluss aus dem Klärbecken für festen Abfall, der durch die Filtermatrix aufsteigt. Proben für diese Studie wurden in drei Tiefen innerhalb des Wirbelsand-Biofilters entnommen, definiert als Oberfläche (~1,32–1,42 m von der Biofilterbasis), Mitte (~0,81–0,91 m von der Biofilterbasis) und Unterseite (~0,15–0,30 m, aus Biofilterbasis). Abbildungen des UWM-Biofilters und der Probenstellen sind in Abbildung dargestellt1 . Die maximale Durchflussrate des Biofilterzuflusses beträgt 757 l pro Minute, was eine hydraulische Verweilzeit von ~9,52 min ergibt. Typische Systemwasserqualitätsparameter sind wie folgt (Mittelwert ± Standardabweichung): pH 7,01 ± 0,09, Oxidations-Reduktions-Potential 540 ± 50 (mV), Wassertemperatur 21,7 ± 0,9 (°C) und gelöster Sauerstoff (DO) des Biofilterabflusses 8,20 ± 0,18 mg/l. Der Biofilter ist für den maximalen Betrieb bei 10 kg Futter pro Tag ausgelegt, was auf der vorhergesagten Ammoniakproduktion durch den Fischproteinabbau bei dieser Fütterungsrate basiert ( Timmons und Ebeling, 2013 ).

ABBILDUNG 1. DARSTELLUNG DES REZIRKULIERENDEN AQUAKULTURSYSTEMS (RAS) DES WIRBELSAND-BIOFILTERS VON UW-MILWAUKEE . Zu Illustrationszwecken ist nur ein einzelnes Zuflussrohr gezeigt. Neunzehn dieser Rohre sind im System vorhanden. Der Wasserfluss ist mit Richtungspfeilen dargestellt, Probenorte sind durch Kreise gekennzeichnet und die Biofilterhöhe ist aufgelistet.

Probenentnahme, -verarbeitung und DNA-Extraktion

Proben von der Oberseite der Biofiltermatrix wurden in autoklavierten 500-ml-Polypropylenflaschen gesammelt. Zwei Proben von der Oberfläche des Biofilters wurden während der letzten 2 Monate eines Gelbbarsch-Aufzuchtzyklus und dann unmittelbar vor Beginn eines neuen Aufzuchtzyklus im System gesammelt. Nachdem das System mit Fischen bestückt wurde, wurden in der ersten Hälfte des neuen Aufzuchtzyklus etwa jede Woche Proben entnommen (die während dieser Studie vorhandenen Gelbbarschstämme brauchen etwa 9 Monate, um auf Marktgröße heranzuwachsen). Nach dem Sammeln wurde Wasser aus den Biofiltermatrixproben zur weiteren Verarbeitung in eine zweite sterile 500-ml-Flasche dekantiert. Dann wurde etwa 1 g Nassgewichtssand aus der Probenflasche entfernt und zur Lagerung vor der DNA-Extraktion bei –80 °C eingefroren. Wasserproben wurden auf 0 filtriert. 22-μm-Filter (47 mm gemischte Celluloseester, EMD Millipore, Darmstadt, Deutschland), eingefroren bei –80 °C und vor der DNA-Extraktion mit einem sterilisierten Spatel mazeriert. Um die räumliche Verteilung von Bakterientaxa separat anzugehen, wurden Tiefenproben aus der Filtermatrix unter Verwendung von 50-ml-Spritzen mit angeschlossenem beschwertem Tygon-Schlauch (3,2 mm ID, 6,4 mm AD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, Frankreich) entnommen. Die Proben wurden nach dem ungefähren Abstand von der Filterbasis als Oberfläche, Mitte und Boden in Kategorien eingeteilt. Der Schlauch wurde mit 10 % Bleichmittel sterilisiert und zwischen den Probenentnahmen dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die DNA wurde separat aus Biofiltersand- und Wasserproben (~1 g Nassgewicht bzw. 100 ml) unter Verwendung des MP Bio FastDNA extrahiert und vor der DNA-Extraktion mit einem sterilisierten Spatel mazeriert. Um die räumliche Verteilung von Bakterientaxa separat anzugehen, wurden Tiefenproben aus der Filtermatrix unter Verwendung von 50-ml-Spritzen mit angeschlossenem beschwertem Tygon-Schlauch (3,2 mm ID, 6,4 mm AD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, Frankreich) entnommen. Die Proben wurden nach dem ungefähren Abstand von der Filterbasis als Oberfläche, Mitte und Boden in Kategorien eingeteilt. Der Schlauch wurde mit 10 % Bleichmittel sterilisiert und zwischen den Probenentnahmen dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die DNA wurde separat aus Biofiltersand- und Wasserproben (~1 g Nassgewicht bzw. 100 ml) unter Verwendung des MP Bio FastDNA extrahiert und vor der DNA-Extraktion mit einem sterilisierten Spatel mazeriert. Um die räumliche Verteilung von Bakterientaxa separat anzugehen, wurden Tiefenproben aus der Filtermatrix unter Verwendung von 50-ml-Spritzen mit angeschlossenem beschwertem Tygon-Schlauch (3,2 mm ID, 6,4 mm AD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, Frankreich) entnommen. Die Proben wurden nach dem ungefähren Abstand von der Filterbasis als Oberfläche, Mitte und Boden in Kategorien eingeteilt. Der Schlauch wurde mit 10 % Bleichmittel sterilisiert und zwischen den Probenentnahmen dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die DNA wurde separat aus Biofiltersand- und Wasserproben (~1 g Nassgewicht bzw. 100 ml) unter Verwendung des MP Bio FastDNA extrahiert Tiefenproben wurden aus der Filtermatrix unter Verwendung von 50-ml-Spritzen mit angeschlossenem beschwertem Tygon-Schlauch (3,2 mm ID, 6,4 mm AD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, Frankreich) entnommen. Die Proben wurden nach dem ungefähren Abstand von der Filterbasis als Oberfläche, Mitte und Boden in Kategorien eingeteilt. Der Schlauch wurde mit 10 % Bleichmittel sterilisiert und zwischen den Probenentnahmen dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die DNA wurde separat aus Biofiltersand- und Wasserproben (~1 g Nassgewicht bzw. 100 ml) unter Verwendung des MP Bio FastDNA extrahiert Tiefenproben wurden aus der Filtermatrix unter Verwendung von 50-ml-Spritzen mit angeschlossenem beschwertem Tygon-Schlauch (3,2 mm ID, 6,4 mm AD; Saint-Gobain SA, La Défense, Courbevoie, Frankreich) entnommen. Die Proben wurden nach dem ungefähren Abstand von der Filterbasis als Oberfläche, Mitte und Boden in Kategorien eingeteilt. Der Schlauch wurde mit 10 % Bleichmittel sterilisiert und zwischen den Probenentnahmen dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die DNA wurde separat aus Biofiltersand- und Wasserproben (~1 g Nassgewicht bzw. 100 ml) unter Verwendung des MP Bio FastDNA extrahiert Der Schlauch wurde mit 10 % Bleichmittel sterilisiert und zwischen den Probenentnahmen dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die DNA wurde separat aus Biofiltersand- und Wasserproben (~1 g Nassgewicht bzw. 100 ml) unter Verwendung des MP Bio FastDNA extrahiert Der Schlauch wurde mit 10 % Bleichmittel sterilisiert und zwischen den Probenentnahmen dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die DNA wurde separat aus Biofiltersand- und Wasserproben (~1 g Nassgewicht bzw. 100 ml) unter Verwendung des MP Bio FastDNA extrahiert^® SPIN Kit for Soil (MP Bio, Solon, OH, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers, außer dass jede Probe 2 Minuten lang mit den im MP Bio FastDNA ^® SPIN Kit enthaltenen Beads bei der einzigen Betriebsgeschwindigkeit des Mini-BeadBeater-16 geschlagen wurde (Biospec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA). DNA-Qualität und -Konzentration wurden unter Verwendung eines NanoDrop ^® Lite (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) überprüft. Probendetails und zugehörige Umweltdaten und molekulare Analysen sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Ammoniak- und Nitritmessungen

Sowohl für die Zeitreihe als auch für die Tiefenprofile wurde ein Seal Analytical AA3 Autoanalyzer (Seal Analytical Inc., Mequon, WI, USA) verwendet, um Ammoniak und Nitrit zu quantifizieren, wobei die vom Hersteller bereitgestellten Phenol- und Sulfanilamidprotokolle auf zwei getrennten Kanälen verwendet wurden. Um nur Nitrit zu quantifizieren, wurde die Cadmiumreduktionssäule nicht in den Auto Analyzer eingebaut. RAS-Bediener zeichneten alle anderen chemischen Parameter von eingetauchten Sonden auf, die Temperatur, pH-Wert und Oxidations-Reduktions-Potenzial maßen. Gemäß den Laborstandardarbeitsanweisungen verwendeten RAS-Bediener kolorimetrische Kits von Hach, um die Konzentrationen von Ammoniak und Nitrit im Aufzuchtbecken zu messen.

16S-rRNA-Gensequenzierung

Um die Lesetiefe für eine zeitliche Untersuchung der Biofilter-Oberflächengemeinschaften zu maximieren, verwendeten wir die Illumina HiSeq-Plattform und zielten getrennt auf die V6-Region des 16S-rRNA-Gens für Archaeen und Bakterien ab. Insgesamt haben wir Gemeindedaten von 15 Terminen für die zeitliche Analyse erhalten. Um Änderungen in der räumlichen Verteilung von Taxa über die Tiefe im Biofilter abzufragen und eine erhöhte taxonomische Auflösung zu erhalten, verwendeten wir die 16S-rRNA-Gen-V4-V5-Regionssequenzierung auf einem MiSeq von Illumina. Wir erhielten Proben aus drei Tiefen n = 5 für die Oberfläche, n = 5 für die Mitte und n= 4 für unten. Beispielmetadaten sind in Tabelle S1 aufgeführt. Extrahierte DNA-Proben wurden an das Josephine Bay Paul Center am Marine Biological Laboratory (V6 Archaea und V6 Bacteria ; V4-V5-Proben vom 8.12.2014 bis 18.2.2015) und an das Great Lakes Genomic Center (V4-V5 Proben vom 18.11.2014, 2.12.2014, 18.12.2014) für die massiv parallele 16S-rRNA-Gensequenzierung unter Verwendung zuvor veröffentlichter bakterieller ( Eren et al., 2013 ) und archaealer ( Meyer et al., 2013 ) V6 Illumina HiSeq und bakterielle V4-V5 Illumina MiSeq-Chemie ( Huse et al., 2014b ; Nelson et al., 2014). Die Reaktionsbedingungen und Primer für alle Illumina-Läufe sind in den oben genannten Zitaten aufgeführt und können abgerufen werden unter: https://vamps.mbl.edu/resources/primers.php#illumina . Sequenzlaufverarbeitung und Qualitätskontrolle für den V6-Datensatz sind in Fisher et al. (2015) , während CutAdapt verwendet wurde, um die V4-V5-Daten von Nukleotiden niedriger Qualität (phred-Score <20) und Primern zu trimmen ( Martin, 2011 ; Fisher et al., 2015 ). Getrimmte Reads wurden mit Illumina-Utils zusammengeführt, wie zuvor beschrieben ( Newton et al., 2015 ). Minimum Entropy Decomposition (MED) wurde für jeden Datensatz implementiert, um Sequenzen (MED-Knoten = Operational Taxonomic Units, OTUs) für die Zusammensetzung der Stichprobengemeinschaft und Diversitätsanalyse zu gruppieren (Eren et al., 2015 ). MED verwendet die über die Shannon-Entropie berechnete Informationsunsicherheit an allen Nukleotidpositionen eines Alignments, um Sequenzen in sequenzähnliche Gruppen aufzuteilen ( Eren et al., 2015 ). Die Sequenzdatensätze wurden mit den folgenden Einstellungen für die substanzielle Mindesthäufigkeit zerlegt: Bakterien V6, 377; archaeal V6, 123; bakteriell V4-V5, 21. Der substanzielle Mindestschwellenwert legt den Häufigkeitsschwellenwert für die Aufnahme von MED-Knoten (dh OTU) in den endgültigen Datensatz fest. Substantielle Mindesthäufigkeiten wurden berechnet, indem die Gesamtzahl der 16S-rRNA-Gensequenzen pro Datensatz durch 50.000 dividiert wurde, wie in den MED Best Practices vorgeschlagen (Sequenzzahlen sind in Tabelle S2 aufgeführt). Der Algorithmus Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST) wurde verwendet, um Sequenz-Reads eine Taxonomie zuzuweisen (Huse et al., 2008 ) und die Website Visualization and Analysis of Microbial Population Structures (VAMPS; Huse et al., 2014a ) wurde für die Datenvisualisierung verwendet.

Comammox -amoA- PCR

Um comammox Nitrospira amoA für die PCR und die anschließende Klonierung und Sequenzierung anzusteuern, wurden amoA- Nukleotidsequenzen von van Kessel et al. (2015) und Daims et al. (2015) wurden mit MUSCLE ( Edgar, 2004 ) ausgerichtet. Das Alignment wurde in EMBOSS importiert, um eine amoA - Konsensussequenz zu erzeugen ( Rice et al., 2000 ). Primersequenzen wurden aus dem Konsensus unter Verwendung von Primer3Plus (Untergasser et al., 2012) identifiziert , und die Kandidaten zusammen mit den von van Kessel et al. (2015), wurden anhand der Konsensussequenz in SeqMan Pro (DNAStar) unter Verwendung von MUSCLE ( Edgar, 2004 ) bewertet. Der pmoA- Vorwärtsprimer ( Luesken et al., 2011 ) und der Kandidaten-Primer COM_amoA_1R (diese Studie; Tabelle 1 ) boten die beste Kombination aus Leselänge und Spezifität und wurden anschließend verwendet, um amoA- Gene aus unseren Proben zu amplifizieren.

Aufbau einer Klonbibliothek und phylogenetische Analyse

Mehrere Endpunkt-PCR-Ansätze wurden verwendet, um die nitrifizierende Gemeinschaftszusammensetzung des RAS-Wirbelsand-Biofilters für amoA ( Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria, Archaea und Comammox Nitrospira ), nxrA ( Nitrobacter spp.) und nxrB (Nicht - Nitrobacter NOB) zu untersuchen. Die verwendeten Primersätze und Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt . Alle Endpunkt-PCR-Reaktionen wurden mit einem Volumen von 25 μl durchgeführt: 12,5 μl 2x Qiagen PCR-Mastermix (Qiagen, Hilden, Deutschland), 1,5 μl geeigneter Primer-Mix (F&R), 0,5 μl Rinderserumalbumin (BSA), 0,75 μl 50 mM MgCl ₂ und 1 μl DNA-Extrakt.

DNA-Proben von Biofilterwasser und -sand aus vier verschiedenen Zeitpunkten des Aufzuchtzyklus wurden verwendet, um Klonbibliotheken von archaealem amoA und Nitrospira sp. nxrB . Eine Probe aus der Mitte des Sandbiofilters wurde verwendet, um Klonbibliotheken für Betaproteobakterien -amoA und Comammox -amoA zu konstruieren . Die mittlere Biofilterprobe wurde ausgewählt, da sie gut definierte Amplikons produzierte, die zum Klonen von Ziel- amoA geeignet warenGene. Alle PCR-Reaktionen für Klonbibliotheken wurden unter Verwendung eines TOPO-PCR-2.1-TA-Klonierungskit-Plasmids (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) konstruiert. Bibliotheken wurden auf einem ABI 3730 Sanger-Sequencer mit M13 Forward-Primern sequenziert. Die Vektorplasmidsequenzkontamination wurde unter Verwendung von DNAStar (Lasergene Software, Madison, WI) entfernt.

Geklonte Sequenzen von Betaproteobacteria amoA, Archaea amoA und Nitrospira nxrB aus dieser Studie wurden zu ARB-Alignment-Datenbanken aus früheren Studien hinzugefügt ( Abell et al., 2012 ; Pester et al., 2012 , 2014 ). Comammox -amoA- Sequenzen aus dieser Studie wurden mit denen von van Kessel et al. abgeglichen. (2015) , Pintoet al. (2015) und Daims et al. (2015) unter Verwendung von MUSCLE und in eine neue ARB-Datenbank importiert, wo die Ausrichtung vor der phylogenetischen Baumrekonstruktion heuristisch korrigiert wurde. Für die AOA, AOB und Nitrospira amoAPhylogenien, Beziehungen wurden unter Verwendung von Maximum-Likelihood (ML) mit RAxML auf dem Cipres Science Gateway ( Miller et al., 2010 ; Stamatakis, 2014 ) und Bayes'scher Inferenz (BI) unter Verwendung von MrBayes mit einer signifikanten A-posteriori-Wahrscheinlichkeit von <0,01 und den zugehörigen berechnet Konsensbaum ( Abell et al., 2012 ; Pester et al., 2012 , 2014 ) von ARB in einen Baumblock innerhalb der Eingabe-Nexus-Datei integriert, um die Berechnungszeit zu reduzieren ( Miller et al., 2010 ; Ronquist et al., 2012 ) . Konsensbäume wurden dann aus den ML- und BI-Rekonstruktionen unter Verwendung des Konsensbaumalgorithmus von ARB berechnet ( Ludwig et al., 2004 ).

Die in dieser Studie generierten Nitrospira-nxrB- Sequenzen waren signifikant kürzer als die für die phylogenetische nxrB- Rekonstruktion in Pester et al. (2014) , daher haben wir keine phylogenetischen Rekonstruktionen wie bei den anderen Markergenen durchgeführt. Stattdessen wurden die Sequenzen UWM Biofilter und Candidatus Nitrospira nitrificans zum Mehrheitskonsensbaum von Pester et al. (2014) unter Verwendung des Quick-Add-Parsimony-Tools des ARB-Pakets ( Ludwig et al., 2004 ). Dieses Werkzeug verwendet Sequenzähnlichkeit, um Sequenzen zu bereits vorhandenen Bäumen hinzuzufügen, ohne die Baumtopologie zu ändern.

qPCR-Assays für Zielmarkergene

Quantitative PCR-Assays wurden entwickelt, um zwei Nitrospira nxrB- Genotypen und zwei Nitrosomonas amoA- Genotypen in unserem System zu unterscheiden. Potenzielle qPCR-Primersequenzen wurden mit Primer3Plus ( Untergasser et al., 2012 ) auf MUSCLE ( Edgar, 2004 ) identifiziert) generierte Alignments in DNAStar (Lasergene Software, Madison, WI). Primerkonzentrationen und Anlagerungstemperaturen wurden für die Spezifität für jedes Reaktionsziel optimiert. Die Primer wurden mit Primer-BLAST auf NCBI überprüft, um sicherzustellen, dass die Assays mit ihren Zielgenen übereinstimmten. Die neu entworfenen Primer wurden unter Verwendung der Nicht-Ziel-Genotypsequenz sowohl in Endpunkt- als auch in Echtzeit-PCR-Verdünnungsreihen auf Kreuzreaktivität zwischen Genotypen getestet. Nach der Optimierung amplifizierten alle Assays nur den Zielgenotyp. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den beiden archaealen amoA- Genotypen (> 90 % Identität) in unserem System wurde ein einziger qPCR-Assay entwickelt, um beide Genotypen unter Verwendung der oben beschriebenen Schritte anzusprechen. Die beiden eng verwandten Sequenztypen wurden in äquimolaren Mengen für Reaktionsstandards gepoolt. Ein KomammoxDas amoA qPCR-Primer-Set wurde mit den gleichen Methoden wie die anderen in dieser Studie vorgestellten Assays entwickelt. Alle Testbedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt . Alle qPCR-Assays wurden auf einem Applied Biosystems StepOne Plus Thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Klonierte Zielgene wurden verwendet, um Standardkurven von 1,5 × 10 ⁶ bis 15 Kopien pro Reaktion zu erstellen. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt, mit Schmelzkurve und Endpunktbestätigung der Assays (qPCR-Standardkurvenparameter und Effizienz sind in Tabelle S3 aufgeführt).

Statistik und Datenanalyse

Taxonomiebasierte Daten wurden mit Heatmaps visualisiert, die in der Statistiksprache R ( R Core Team, 2014 ) erstellt wurden, indem Funktionen aus den Bibliotheken gplots, Heatplus von Bioconductor Lite, VEGAN und RColorBrewer implementiert wurden. MED-Knoten wurden in allen Stichprobendiversitätsmetriken verwendet. Die EnvFit-Funktion im VEGAN ( Oksanen et al., 2015 ) R-Paket wurde verwendet, um die Beziehung zwischen RAS-Beobachtungsdaten und Änderungen in der Zusammensetzung der Biofilter-Bakteriengemeinschaft zu testen. Pearsons Korrelationen wurden unter Verwendung des Hmisc-Pakets in R ( Harrell, 2016 ) berechnet, um zu testen, ob 16S- rRNA-, amoA- und nxrB -Genkopien im Laufe der Zeit korrelierten. Kruskal-Wallis-Rangsummentests wurden im R-Basisstatistikpaket (R Core Team, 2014 ), um zu testen, ob die Populationen der oben genannten Gene nach Tiefe stratifiziert waren. Die ADONIS-Funktion von VEGAN wurde auf dem V4-V5-Tiefendatensatz verwendet, um die Signifikanz der beobachteten Bray-Curtis-Unähnlichkeit als Funktion der kategorialen Faktoren der Tiefe zu testen, mit Strata = NULL, da derselbe Biofilter mehrmals abgetastet wurde.

Biomasse-Modell

Um zu bestimmen, ob die beobachtete Ammoniakentfernung die Energie liefern könnte, die erforderlich ist, um die Anzahl potenzieller Ammoniak-oxidierender Mikroorganismen (AOM) im Biofilter zu unterstützen, wie sie über qPCR quantifiziert wurde, haben wir die stationäre Biomassekonzentration aus der gemessenen Ammoniakoxidation mit der folgenden Gleichung modelliert: 

 X _AO ist in früheren Modellen ( Mußmann et al., 2011 ) als Biomassekonzentration von Ammoniakoxidationsmitteln in Milligramm pro Liter definiert , in dieser Studie haben wir jedoch in Zellen pro feuchtem Gramm Sand umgerechnet, indem wir die mittleren Gramm Sand pro Liter ermittelt haben Wasser im Biofilter. Θ _x ist die mittlere Zellverweilzeit (MCRT) in Tagen und war für das System unbekannt. Θ ist die hydraulische Verweilzeit in Tagen, die in diesem System ~9,52 min oder 0,0066 Tage beträgt. Y _AO ist die Wachstumsausbeute von Ammoniakoxidierern und b _AO ist die endogene Respirationskonstante von Ammoniakoxidierern, die auf 0,34 kg flüchtige suspendierte Feststoffe (VSS)/kg NH4 ⁺ –N und 0,15 d ^{–1 geschätzt wurden}von Mußmann et al. (2011) . Δ S _NH 3 ist die Änderung der Substratammoniakkonzentration zwischen Zulauf und Ablauf in mg/l. Zur Berechnung von X _AO oder Biomassekonzentration haben wir den mittleren Zelldurchmesser (0,96 μm) für Candidatus Nitrosocosmicus franklandus ( Lehtovirta-Morley et al., 2016 ) verwendet, um das Biovolumen einer einzelnen Zelle zu berechnen, und den Umrechnungsfaktor von 310 fg verwendet *C/μm ³ ( Mußmann et al., 2011 ) um das Biovolumen mit der endogenen Atmung in Beziehung zu setzen. Die modellierte Biomassekonzentration wurde gegen einen Bereich potenzieller MCRT für einen RAS-Wirbelsandfilter aufgetragen (Summerfelt, persönliche Mitteilung). Die Ergebnisse alleramoA qPCR-Assays wurden kombiniert, um die gesamte Ammoniak-oxidierende Mikroorganismen-Biomasse in Kopienzahlen pro Gramm Nassgewicht Sand abzuschätzen. Die modellierte Biomasse wurde dann mit unseren AOM-qPCR-Assay-Ergebnissen verglichen. Ein kommentiertes R-Skript für das Modell ist auf GitHub verfügbar ( https://github.com/rbartelme/BFprojectCode.git ).

NCBI-Sequenz-Zugriffsnummern

Bakterielle V6-, V4-V5- und Archaeal-V6-16S-rRNA-Gensequenzen, die in dieser Studie generiert wurden, sind bei der NCBI SRA (SRP076497; SRP076495; SRP076492) erhältlich. Partielle Gensequenzen für amoA und nxrB sind über die NCBI Genbank erhältlich und haben die Zugangsnummern KX024777–KX024822.

Ergebnisse

Ergebnisse der Biofilterchemie

Die RAS-Betriebsdaten wurden vom Beginn eines Gelbbarsch-Aufzuchtzyklus bis etwa 6 Monate danach untersucht. Die mittleren Biofilter-Zuflusskonzentrationen von Ammoniak und Nitrit waren jeweils 9,02 ± 4,76 und 1,69 ± 1,46 μM. Die Biofilterabwasser-Ammoniakkonzentrationen (3,84 ± 7,32 μM) blieben innerhalb der toxikologischen Beschränkungen (< 60 μM) von P. flavescens , die im System gezüchtet wurden. Gelegentlich reicherte sich Nitrit über dem empfohlenen Schwellenwert von 0,2 μM sowohl im Aufzuchtbecken (0,43 ± 0,43 μM) als auch im Biofilterabfluss (0,73 ± 0,49 μM) an. Während der Betriebszeit des RAS wurden keine größeren Fischkrankheiten gemeldet. Umgebungs- und Betriebsdaten sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Bakterien- und Archaea-Ansammlungen innerhalb des Biofilters

Die Charakterisierung der RAS-Biofilter-Bakteriengemeinschaft zeigte, dass sowohl die sandassoziierten als auch die Wassergemeinschaften auf einer breiten taxonomischen Ebene vielfältig waren; 17 Phyla lagen im Durchschnitt bei >0,1 % in jeder der Biofilter-Sand- und Wasserbakteriengemeinschaften (siehe Tabelle S2 für eine beispielhafte taxonomische Charakterisierung der Gattung). Proteobakterien (im Durchschnitt 40 % der Biofilter-Sandgemeinschaftssequenzen und 40 % der Wassersequenzen) und Bacteroidetes (18 % in Sand, 33 % in Wasser) dominierten sowohl Wasser- als auch Sandbakteriengemeinschaften. Bei der taxonomischen Klassifizierung auf Familienebene unterschied sich die mit Biofiltersand assoziierte Gemeinschaft von der Wassergemeinschaft. Der größte Teil der Sequenzen in den Sandproben wurde den Bakteriengruppen Chitinophagaceae zugeordnet(durchschnittliche relative Häufigkeit 12 %), Acidobacteria- Familie unbekannt (9 %), Rhizobiales - Familie unbekannt (6 %), Nocardioidaceae (4 %), Spartobacteria- Familie unbekannt (4 %) und Xanthomonadales - Familie unbekannt (4 %). Wasserproben wurden von Sequenzen dominiert, die als Chitinophagaceae (14 %), Cytophagaceae (8 %), Neisseriaceae (8 %) und Flavobacteriaceae (7 %) klassifiziert wurden. Auf Gattungsebene waren Kribbella, Chthoniobacter, Niabella und Chitinophaga die zahlreichsten klassifizierten Taxa, jeweils mit durchschnittlich >3 % relativer Häufigkeit in den Biofilterproben.

Unter Verwendung von Minimum Entropy Decomposition (MED), um eine hochgradig diskriminierende Sequenzeinteilung zu erhalten, identifizierten wir 1261 Knoten (OTUs) im gesamten Bakteriendatensatz. Ein MED-basierter Vergleich der Bakteriengemeinschaftszusammensetzung (Abbildung 1 ) unterstützte die Muster, die unter Verwendung einer breiteren taxonomischen Klassifizierung beobachtet wurden, was darauf hinweist, dass die Biofiltersand-assoziierte Gemeinschaft sich von der im Biofilterwasser vorhandenen Ansammlung unterschied.

Im Gegensatz zu der großen Diversität in der Bakteriengemeinschaft stellten wir fest, dass die archaeale Gemeinschaft von einer einzigen taxonomischen Gruppe dominiert wird, die der Gattung Nitrososphaera angehört

Dieses Taxon machte > 99,9 % der Archaea -klassifizierten Sequenzen aus, die in den Biofilterproben identifiziert wurden (Tabelle S2). Dieses Taxon war auch fast vollständig durch eine einzelne Sequenz (> 95 % der als Archaea klassifizierten Sequenzen) repräsentiert, die mit einer Reihe von in der Datenbank hinterlegten Thaumarchaeota - Sequenzen identisch war, einschließlich des vollständigen Genoms von Candidatus Nitrosocosmicus oleophilus (CP012850), zusammen mit Klonen aus aktivierten Klärschlamm, Abwasserbehandlung und Süßwasseraquarien (KR233006, KP027212, KJ810532–KJ810533).

Die anfängliche Charakterisierung der Biofiltergemeinschaftszusammensetzung ergab unterschiedliche Gemeinschaften zwischen dem Biofiltersand und dekantiertem Biofilterwasser (Abbildung 2 ). Basierend auf diesen Daten und der Tatsache, dass die Wirbelschichtbiofilternitrifikation hauptsächlich in partikelgebundenen Biofilmen stattfindet ( Schreier et al., 2010 ), haben wir unsere weiteren Analysen auf die Biofiltersandmatrix konzentriert. In den Sandproben beobachteten wir im Laufe der Zeit eine signifikante Veränderung der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft (MED-Knoten) (Tabelle 2). Der frühe Teil der Studie, der einen Zeitraum umfasste, in dem Gelbbarsche in Marktgröße im System vorhanden waren (Probe –69 und –26), eine Brachezeit nach der Entfernung der Fische (Probe 0) und die Zeit nach der Wiederaufstockung von Misch- Jungfische (Probe 7 und 14) hatten eine variablere Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft (mittlere Bray-Curtis-Ähnlichkeit 65,2 ± 6,5 %) als die übrigen Proben ( n = 9), die zu Zeitpunkten gesammelt wurden, nachdem eine Futterquelle für ausgewachsene Tiere begonnen worden war ( 20,0 ± 6,4 %, Abbildung 3 ). Mehrere betriebliche und gemessene physikalische und chemische Parameter, einschließlich Oxidations-Reduktions-Potential, Beschickungsgröße, Leitfähigkeit und Nitrit aus dem Biofilter wurden korreliert ( S< 0,05) mit den zeitabhängigen Änderungen in der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft (siehe Tabelle 2 für Umweltkorrelationsergebnisse).

	ABBILDUNG 2.DENDROGRAMM, DAS DIE ZUSAMMENSETZUNGSBEZIEHUNGEN DER BAKTERIENGEMEINSCHAFT ZWISCHEN BIOFILTERSAND- UND BIOFILTERWASSERPROBEN VERANSCHAULICHT . Ein Complete-Linkage-Dendogramm wird anhand von Bray-Curtis-Stichproben-Unähnlichkeitsbeziehungen dargestellt, die auf Knotenverteilungen der minimalen Entropiezerlegung zwischen Stichproben basieren (V6-Datensatz). Die Blätter des Dendrogramms sind mit der Tageszählung beschriftet, wobei 0 den Beginn eines Fischaufzuchtzyklus darstellt. Negative Zahlen sind Tage vor einem neuen Aufzuchtzyklus. Auf die Tageszählung folgt das Datum der Probenahme (MM.TT.JJ). Siehe Tabelle S1 für Beispielmetadaten.
	TABELLE 2.KORRELATIONEN ZWISCHEN UMWELTVARIABLEN UND DER ZUSAMMENSETZUNG DER BAKTERIENGEMEINSCHAFT .
	ABBILDUNG 3.NICHTMETRISCHES MULTIDIMENSIONALES SKALIERUNGSDIAGRAMM DER UNÄHNLICHKEIT DER ZUSAMMENSETZUNG DER BRAY-CURTIS-BAKTERIENGEMEINSCHAFT ZWISCHEN DEN STICHPROBENZEITPUNKTEN . nMDS Stress = 0,07 und Dimensionen (k) = 2. Pfeile zeigen den Verlauf der Probe durch die Zeit vom Ende eines Aufzuchtzyklus (Tagnummer –69 und –26) zu einem Zeitraum ohne Fische (0) und in die nachfolgende Aufzucht Zyklus (7–126). Der Kreis zeigt Proben, die genommen wurden, nachdem die Fische auf eine Größe angewachsen waren, bei der Futterart und -menge stabilisiert waren (3 mm pelletiertes Futter und 3–7 kg Futter pro Tag).
Unter Verwendung eines zweiten Sequenzdatensatzes (V4-V5 16S rRNA-Gensequenzen) untersuchten wir die mit Sand assoziierte Bakteriengemeinschaftszusammensetzung über einen Tiefengradienten (Oberfläche, Mitte, Boden). Wir fanden heraus, dass sich die Bakteriengemeinschaften in den oberen Sandproben von denen in der Mitte und unten unterschieden (ADONIS R 2 = 0,74, p = 0,001; Abbildung 4 ). Die Planctomyceten stellten einen größeren Teil der Gemeinschaft im Oberflächensand dar (im Durchschnitt 15,6 % des Oberflächensands gegenüber 9,6 % des mittleren/unteren Sands), während die mittleren und unteren Schichten einen größeren Anteil an Chitinophagaceae beherbergten (7,4 % im Oberflächensand vs 16,8 % Mitte/unten) und Sphingomonadaceae(2,4 % in der Oberfläche vs. 7,9 % in der Mitte/unten; Abbildung 4 ).
	ABBILDUNG 4.TIEFENVERGLEICH DER ZUSAMMENSETZUNG DER BAKTERIELLEN BIOFILTERGEMEINSCHAFT . Eine Heatmap wird für alle Bakterienfamilien mit einer relativen Häufigkeit von ≥ 1 % in jeder Probe dargestellt. Die relative Taxonhäufigkeit wurde aus der V4–V5-16S-rRNA-Gensequenzierung generiert und ist mit einer Skala von 0 bis 25 % angegeben. Das Dendrogramm repräsentiert die Bray-Curtis-Unähnlichkeit zwischen der Zusammensetzung der Probengemeinschaft. Proben-IDs werden aufgelistet und die Probentiefe wird durch auf dem Diagramm neben dem Dendrogramm angezeigt. Probennamen entsprechen Probenmetadaten in Tabelle S1.

Zusammensetzung und Phylogenie der Nitrifikationsgemeinschaft

Die massiv parallelen 16S-rRNA-Gensequenzierungsdaten zeigten, dass Bakterientaxa, die nicht mit Nitrifikation assoziiert sind, die Mehrheit (~92 %) der Sandbiofilter-Bakteriengemeinschaft ausmachten. Im Gegensatz dazu wurden > 99,9 % der archaealen 16S-rRNA-Gensequenzen einem einzelnen Taxon zugeordnet, das mit bekannter AOA assoziiert ist. Unter den Bakterientaxa stellte Nitrosomonas <1 % der Gesamtgemeinschaft in allen Proben dar, und es wurden keine Nitrobacter -Sequenzen erhalten. Wir waren auch nicht in der Lage, Nitrobacter nxrA- Gene (Abbildung S1) mit einem allgemein verwendeten Primer-Set zu amplifizieren ( Poly et al., 2008 ; Wertz et al., 2008 ). Im Gegensatz dazu war Nitrospira ziemlich reichlich vorhanden und machte 2–5 % der gesamten Bakteriengemeinschaft aus (Tabelle S2).

Zusätzlich zu den Daten der 16S-rRNA-Gengemeinschaft amplifizierten, klonierten und sequenzierten wir nitrifizierende Markergene, die die dominanten nitrifizierenden Taxa im UWM-Biofilter darstellen. Die archaealen amoA -Sequenzen (KX024777–KX024795) gruppierten sich in zwei unterschiedliche Genotypen mit einer durchschnittlichen Nukleotididentität von 97 bis 99 %. Beide Genotypen wurden phylogenetisch im Nitrososphaera -Schwestercluster platziert (Abbildung 5 ), der die Kandidatengattung Nitrosocosmicus umfasst ( Lehtovirta-Morley et al., 2016 ), aber die Sequenzen waren am engsten mit den amoA- Genen von Archaeon G61 (97 % Nukleotid Identität; KR233005). Sequenzierte Amplikons für betaproteobakterielles amoA(KX024803–KX024810) enthüllten auch das Vorhandensein von zwei AOB-Genotypen, die mit Nitrosomonas assoziiert sind . Diese Nitrosomonas -Genotypen waren am engsten verwandt (99 % Identität) mit Umweltsequenzen, die aus Süßwasseraquarien und Belebtschlamm erhalten wurden ( 6 ).

	ABBILDUNG 5.AMMONIAK-OXIDIERENDER ARCHAEA-KONSENSBAUM . Ein phylogenetischer Konsensbaum wurde aus phylogenetischen Rekonstruktionen mit maximaler Wahrscheinlichkeit und Bayes'scher Inferenz generiert. Die Unterstützung von Konsensbäumen wird durch farbige Kreise an Baumknoten angezeigt. Eingeklappte Knoten und zugewiesene Namen basieren auf Pester et al. (2012) . Auf Klon- und taxonomische Namen folgen NCBI-Zugangsnummern. Ammoniak-oxidierende Archaea-amoA-Sequenzen, die in dieser Studie generiert wurden, sind hervorgehoben
	ABBILDUNG 6.KONSENSBAUM DER AMMONIAK-OXIDIERENDEN BAKTERIEN . Ein phylogenetischer Konsensbaum wurde aus phylogenetischen Rekonstruktionen mit maximaler Wahrscheinlichkeit und Bayes'scher Inferenz generiert. Die Unterstützung von Konsensbäumen wird durch farbige Kreise an Baumknoten angezeigt. Eingeklappte Knoten und zugewiesene Namen basieren auf Abell et al. (2012) . Auf Klon- und taxonomische Namen folgen NCBI-Zugangsnummern. Die Klade, die den Nitrosomonas-amoA- Genotyp enthält, UWM - Nitroso - 1 -amoA ist grün hervorgehoben, und UWM - Nitroso -2-amoA ist gelb hervorgehoben.
Der UWM-Biofiltersand beherbergte auch zwei phylogenetisch unterschiedliche und divergente Kladen von nxrB- Sequenzen (85–86 % Nukleotididentität zwischen den Genotypen; KX024811–KX024822), die der Gattung Nitrospira angehörten . Nitrospira nxrB uwm-1 bildete eine Klade, die sich von kultivierten Nitrospira spp. (~92 % Nukleotididentität mit Nitrospira bockiana ). Nitrospira nxrB uwm-2 gruppierte sich phylogenetisch mit Nitrospira spp., die an der vollständigen Nitrifikation beteiligt waren (d. h. Comammox; Daims et al., 2015 ; van Kessel et al., 2015 ; Abbildung 7A ). Wegen der Vereinigung vonNitrospira nxrB uwm–2 mit comammox nxrB - Sequenzen untersuchten wir den Biofilter weiter auf das Vorhandensein von Nitrospira -ähnlichen amoA- Genen. Anschließend amplifizierten wir ein einzelnes Nitrospira - ähnliches amoA aus den Biofilterproben, und die phylogenetische Inferenz platzierte dieses amoA auf einem monophyletischen Zweig mit derzeit bekannten Nitrospira-amoA- Sequenzen, aber in einem bestimmten Cluster (Abbildung 7B ) mit einem Trinkwasser-Metagenom-Contig ( Pinto et al., 2015 ) und ein „Crenothrix pmoA/amoA “ Paddy Soil Clone (KP218998; van Kessel et al., 2016). Einen Link zu ARB-Datenbanken mit diesen Daten finden Sie unter https://github.com/rbartelme/ARB_dbs .
	ABBILDUNG 7.KONSENS-STAMMBÄUME FÜR NITROSPIRA - ÄHNLICHE (A) nxrB- und (B) amoA- Gene. Für die nxrB-Phylogenie wurde der Konsensbaum von Pester et al. (2014) ist illustriert. Die UWM-Biofilter- und Candidatus Nitrospira nitrificans-Sequenzen wurden dieser phylogenetischen Rekonstruktion mit dem Quick-Add-Parsimony-Tool des ARB-Pakets ( Ludwig et al., 2004 ) hinzugefügt, um die Baumtopologie nicht zu verändern. Für die amoAPhylogenie wurde ein phylogenetischer Konsensbaum aus phylogenetischen Rekonstruktionen mit maximaler Wahrscheinlichkeit und Bayes'scher Inferenz generiert. Die Unterstützung von Konsensbäumen wird durch farbige Kreise an Baumknoten angezeigt. Den Klonnamen folgen NCBI-Zugangsnummern oder ein Manuskriptzitat. In beiden Bäumen sind in dieser Studie generierte Sequenzen mit farbigen Kästchen hervorgehoben.
Zeitliche und räumliche Quantifizierung von Nitrifikationsmarkergenen Wir haben die zeitliche und räumliche Stabilität der nitrifizierenden Organismen im UWM-Biofilter untersucht, indem wir qPCR-Assays entwickelt haben, die spezifisch für identifizierte amoA- und nxrB- Gene sind. Innerhalb der Ammoniak-oxidierenden Gemeinschaft hatten AOA und Comammox- Nitrospira ( amoA -Assay) Raum-Zeit-Häufigkeitsmuster, die sich von denen der Nitrosomonas - Genotypen unterschieden. Beispielsweise waren AOA und Comammox- Nitrospira in allen Proben zahlenmäßig dominant (Bereich = 450–6500:1) gegenüber Nitrosomonas (kombinierte UWM-Nitroso-1- und Nitroso-2-Genotypen) (Abbildung 8 ; Tabelle 3 ). Die AOA und comammox- Nitrospirahatte im Laufe der Zeit auch stabilere Häufigkeiten [Variationskoeffizient (CV) = 0,38 und 0,55 vs. 1,33 und 1,32 für Nitroso-1 und Nitroso-2; Abbildung 8 ], Kopienzahlkonzentrationen, die weniger von der Tiefe des Biofilters beeinflusst wurden (Tabelle 3 ), und Comammox- Nitrospira waren im gesamten Biofilter etwa 1,9-mal häufiger als AOA. Schließlich zeigten die beiden Nitrosomonas-amoA- Genotypen eine starke zeitliche Häufigkeitskorrelation (Pearsons R = 0,90, Pseudo - p = 0,0002), die nicht mit AOA oder dem Comammox - Nitrospira geteilt wurde (Pearsons R = 0,65 und 0,69 und Pseudo - p = 0,031 und 0,019) . , beziehungsweise).
	ABBILDUNG 8. KONZENTRATION DES NITRIFIKATIONSMARKERGENS ÜBER DIE ZEIT . Diagramm (A) veranschaulicht die amoA - Kopienzahl (CN) pro Gramm Biofiltersand und Diagramm (B) nxrB CN pro Gramm Biofiltersand für alle identifizierten Genotypen. Die Standardabweichung der dreifachen qPCR-Reaktionen ist für jede Probe angegeben. Die x-Achse gibt die Zeit an, wobei der Zeitpunkt 0 den Beginn eines Fischaufzuchtzyklus darstellt. Proben, die im vorherigen Aufzuchtzyklus gesammelt wurden, sind mit negativen Werten gekennzeichnet. Siehe Tabelle S1 für Beispielmetadaten.
	TABELLE 3.NITRIFIKATIONSMARKERGENKONZENTRATIONEN IN BIOFILTERSAND .
	ABBILDUNG 9.HEATMAP DER HÄUFIGKEITSMUSTERKORRELATIONEN FÜR NITRIFIKANTEN-GENOTYPEN . Pearson-Korrelationskoeffizientenwerte (r) sind aufgelistet und gemäß der Stärke der Häufigkeitskorrelation zwischen Markergenen für jeden Genotyp gefärbt. Violette Farben zeigen stärkere Korrelationen und grüne Farben zeigen schwächere Korrelationen an.
Ammoniak-oxidierendes Mikroorganismus-Biomassemodell Die geschätzten Zelldichten für Ammoniak-Oxidationsmittel im Biofilter wurden als Funktion der mittleren Zellverweilzeit (MCRT) modelliert. Da die MCRT des Biofilters unbekannt war, wurde im Modell ein Wertebereich (1–30 Tage) verwendet. Das Modell legt nahe, dass die kombinierten geschätzten Ammoniak-Oxidationsmittel-Zelldichten ( Nitrosomonas + AOA + Commamox- Nitrospira ) durch die beobachtete Ammoniak-Oxidation gestützt werden könnten, und überschätzte diese Dichten tatsächlich. Zum Beispiel zeigt das Modell an, dass die Ammoniak-Oxidationsmittel-Biomasse bei einer mittleren Zellverweilzeit (MCRT) von 20 Tagen fast das Maximum erreicht ( 10 ). Bei dieser 20-tägigen MCRT zeigt das Modell an, dass die gemessene Ammoniakentfernungsrate ~6,2-mal mehr Zellen unterstützen könnte, als wir beobachtet haben (Abbildung 10 ).
	ABBILDUNG 10.MODELLAUSGABE DER AMMONIAK-OXIDATIONSMITTEL-ZELLKONZENTRATION ALS FUNKTION DER MITTLEREN ZELLVERWEILZEIT (MCRT) DES BIOFILTERS . Die rote Linie zeigt Schätzungen der Ammoniak-Oxidationsmittel-Zellhäufigkeit aus der mittleren Änderung der Ammoniakkonzentration über die Filtermatrix als Funktion der mittleren Zellverweilzeit. Der schattierte graue Bereich stellt den Bereich der Zellhäufigkeitsschätzungen aus den minimal und maximal beobachteten Ammoniakentfernungsraten dar. Die horizontale gestrichelte Linie zeigt die qPCR-geschätzte Gesamt-Ammoniak-Oxidationsmittel-Häufigkeit (Ammoniak-oxidierende Archaea + Ammoniak-oxidierende Bakterien + Comammox Nitrospira ) im System an.

Diskussion

Zusammensetzung der mikrobiellen Biofilter-Gemeinschaft

In dieser Studie haben wir Daten generiert, die die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft für einen nitrifizierenden RAS-Süßwasser-Biofilter im Produktionsmaßstab eingehend untersucht und unser Verständnis der Komplexität dieser Systeme über frühere Berichte hinaus erweitert haben ( Sugita et al., 2005 ; Sauder et al., 2011 ; Blancheton et al., 2013 ). Diese tiefere Abdeckung gab uns die Möglichkeit, zeitliche und tiefe Verteilungen sowohl für die gesamten bakteriellen als auch für die archaealen Gemeinschaften und die potenziellen nitrifizierenden Mitgliedskonsortien darin zu untersuchen. In früheren Studien von Süßwasser-RAS-Biofiltern wurden Actinobacteria, Gammaproteobacteria, Plantomycetes und Sphingobacteria als dominante Taxa identifiziert, wenn auch auf verfeinerten taxonomischen EbenenAcinetobacteria, Cetobacterium, Comamonas, Flectobacillus, Flavobacterium und Hyphomicrobium waren weit verbreitet ( Sugita et al., 2005 ). Alle diese Gattungen waren in unseren Biofiltersandproben vorhanden und relativ häufig (> 0,5 % Gesamtgemeinschaft; taxonomische Aufschlüsselung auf Gattungsebene in Tabelle S2), was darauf hindeutet, dass möglicherweise ein Selektionsdruck für Heterotrophe besteht, die systemübergreifend wirken. Einige Forscher haben die Hypothese aufgestellt, dass jeder RAS-Biofilter eine einzigartige mikrobielle Gemeinschaftszusammensetzung haben sollte, die durch Betriebskontrollen und Komponenten, die im RAS implementiert sind, geformt wird ( Sugita et al., 2005 ; Blancheton et al., 2013 ). Untermauert wird diese Idee von vielen der am häufigsten vorkommenden Bakteriengattungen in unserem System (z.Kribbella, Niabella, Chitinophaga, Byssovorax, Hyphomicrobium ) wurde in anderen Systemen nicht als häufig gemeldet. Während es wahrscheinlich zutrifft, dass jede mikrobielle Gemeinschaft unter den RAS-Biofiltern einzigartig sein wird, d. h. jeder Biofilter einen einzigartigen „mikrobiellen Fingerabdruck“ hat, ist die geringe Anzahl von RAS-Biofiltern mit Informationen über die Zusammensetzung der Gemeinschaft bis heute und die geringe Sequenzierungstiefe in bestehenden Studien, verbietet es, belastbare systemübergreifende Vergleiche anzustellen und zugrunde liegende Trends bei der Zusammensetzung der Community zu identifizieren, die sich auf den Systembetrieb beziehen.

Von verschiedenen Komponenten von RAS wird erwartet, dass sie einzigartigen Umgebungsselektivitätsdrücken ausgesetzt sind, und daher sollten mehrere unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaften innerhalb eines einzigen RAS vorhanden sein. Unsere Gemeinschaftsdaten zeigen, dass es konsistente und signifikante Unterschiede in den Biofiltersand- und Wassergemeinschaften gibt. Zu diesen Unterschieden gehörten Gemeindemitglieder, die in den Wasserproben allgegenwärtig, aber fast ausschließlich waren. Diese Taxa könnten Restmitglieder sein, die von früheren Komponenten im System stammen (z. B. Aufzuchttank, Klärbecken), aber die hohe Scherkraft in einem Wirbelsandbett kann zu einem unbeständigen Durchgang dieser einströmenden Mikroorganismen führen. Die Wasserproben zeigten auch eine verringerte Darstellung prominenter sandassoziierter Taxa, einschließlich der meisten bekannten Nitrifikanten, Daher würden Studien, bei denen Biofilter-Abflusswasser entnommen wird, die mit der Nitrifikation verbundenen mikrobiellen Ansammlungen nicht genau darstellen. Diese Beobachtungen stützen frühere Beobachtungen mit dem gleichen Effekt und unterstützen weiter die Idee, dass sich eine vorübergehende planktonische mikrobielle Ansammlung ständig durch RAS-Komponenten bewegt, während sich eine unabhängige Gemeinschaft auf den Biofiltermedien entwickelt (Blancheton et al., 2013 ).

Unsere Zeitreihen zeigen, dass die Veränderung der Zusammensetzung der RAS-Biofilter-Bakteriengemeinschaft mit Veränderungen der Umweltparameter im Zusammenhang mit dem Fischwachstum korreliert (dh Anzahl der Fische, Wassertemperatur, Leitfähigkeit, Oxidations-Reduktions-Potenzial und Futtergröße). Dieses Ergebnis stimmt mit der Hypothese überein, dass die Variation der Biofilter-Bakteriengemeinschaft durch das Futter und das Fischwachstum verursachten Verschiebungen im C/N-Verhältnis folgt ( Michaud et al., 2006 , 2014). Die Variabilität der Gemeinschaft ist anscheinend auf die nicht-nitrifizierenden Mitglieder des Biofilters beschränkt, da sich die Zusammensetzung oder Häufigkeit der dominanten nitrifizierenden Organismen im Laufe der Zeit kaum verändert hat. Die Probenahme in verschiedenen Tiefen des Biofilters ergab unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaften in jeder Sandschicht, was auf eine mögliche Aufteilung über physikalische und chemische Gradienten innerhalb des Biofilters hindeutet. Im Gegensatz zu den beobachteten zeitlichen Schwankungen waren diese Unterschiede sowohl in den heterotrophen Ansammlungen als auch in der Häufigkeit von Nitrifikanten vorhanden. Es scheint, dass dieser Biofilter eine stabile, aber in die Tiefe unterteilte nitrifizierende Gemeinschaft inmitten einer sich verändernden Bakteriengemeinschaft aufrechterhält, deren Zusammensetzung mit Schwankungen in der Nährstoffzufuhr verbunden ist, die letztendlich aus dem Ergebnis des Fischwachstums stammt.

Im Allgemeinen wird die heterotrophe mikrobielle Gemeinschaft des RAS-Biofilters nur als konkurrierend mit den Nitrifizierern um Ressourcen angesehen, und die Systemdesign-Richtlinien empfehlen den Betrieb auf der Grundlage dieser Prämisse ( Okabe et al., 1995 ). Diese Ansicht kann jedoch die weitere Entwicklung der Biofiltertechnologie einschränken, da sich herausstellt, dass der Kontext heterotropher Lebensgemeinschaften eine breitere Rolle bei der Nitrifikation spielen kann. Unsere Daten zeigen deutlich, dass die heterotrophe Gemeinschaft während „typischer“ Fischaufzuchtzyklen erheblich variiert. In einigen Szenarien ist es möglich, dass diese Änderungen die Nitrifikation beeinflussen. Beispielsweise ist bekannt, dass bestimmte Heterotrophe die Nitrifikationsraten in Nitrosomonas- und Nitrobacter- Bioreaktoren erhöhen ( Sedlacek et al., 2016). Es ist nicht bekannt, ob sich diese Wechselwirkungen auf andere Ammoniak- und Nitrit-oxidierende Taxa oder andere Systeme erstrecken, aber das Zusammenspiel zwischen Heterotrophen und Nitrifikanten als Mittel zur Erhöhung der Nitrifikationsraten in RAS sollte untersucht werden. Weitere Daten über Systeme hinweg und über längere Zeiträume in einem einzelnen System werden ebenfalls benötigt, um die „normale“ vs. stochastische Systemvariabilität einzugrenzen und wichtige Taxa- oder Community-Assembly-Prinzipien zu identifizieren, die RAS regeln.

Schlüsselwörter: rezirkulierendes Aquakultursystem, Biofilter, Nitrifizierer, Ammoniak-oxidierende Archaeen, Comammox, mikrobielle Gemeinschaften, Nitrospira

Zitat: Bartelme RP, McLellan SL und Newton RJ (2017) Freshwater Recirculating Aquaculture System Operations Drive Biofilter Bacterial Community Shifts around a Stable Nitrifying Consortium of Ammonia-Oxidizing Archaea and Comammox Nitrospira . Vorderseite. Mikrobiol . 8:101. doi: 10.3389/fmicb.2017.00101

Rezensiert von: Uwe Strotmann , Westfälische Hochschule, Deutschland, Sebastian Lücker , Radboud University Nijmegen, Niederlande, Hidetoshi Urakawa , Florida Gulf Coast University, USA

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