Der Photometrie liegt das Prinzip zugrunde, dass jeder Farbstoff spezifisch bei einer bestimmten Wellenlänge abhängig von der Konzentration und der Schichtdicke absorbiert.

Dieser Zusammenhang wird im Lambert-Beer'schen Gesetz beschrieben.

Ein Photometer hat immer denselben Aufbau:

• Lichtquelle
• Monochromator
• Probe in Küvette
• Detektor

Die Probe

Extinktion als zentraler Wert

Was ist Extinktion ?

Die Extinktion ist der dekadische Logarithmus des Verhältnisses der Anfangsintensität und der Intensität nach Probendurchgang. Durch den Intensitätsverlust lässt sich die Konzentration bestimmen.

Die Extinktion darf nicht mit der Absorption verwechseln werden. Die Extinktion umfasst alle lichtschwächenden Ereignisse. Folgende lichtschwächenden Ereignisse können in unserer Probe auftreten:

• Die Absorption der Wellenlänge durch die Moleküle der Probe in der Lösung,
• die Brechung von Licht in einer inhomogenen, milchigen Lösung an den Partikeln der Probe,
• die Reflexion an der Flüssigkeitsoberfläche oder der Küvette.
  

Aufbereitung der Probe

Um die Absorption spezifisch messen zu können, müssen folgende Dinge beachtet werden:

• Die Probe muss gut gelöst sein: Es sollten keine Partikel mehr herumschwirren, die die Probe milchig oder inhomogen machen.
• Es muss eine Kalibriermessung mit der Küvette und dem Lösungsmittel durchgeführt werden. Das heißt, dass das Lösungsmittel (meistens Wasser) und die Küvette in das Photometer gestellt werden und kalibriert werden muss. (Den Knopf Kalibrieren drücken).

Das Photometer misst nun erneut die Extinktion. Da aber kein Farbstoff enthalten ist, wird nur die Reflexion an dem Wasser und an der Küvette gemessen, die in den nachfolgenden Messungen von der Extinktion abgezogen wird. Werden diese Schritte befolgt, misst man erfolgreich mit der Extinktion auch ausschließlich die Absorption.

Die Photometrie und das Lambert-Beer'sches Gesetz

Was sagt uns nun die Extinktion ? Hier gilt das Lambert-Beer'sche Gesetz. Dieses stellt die Extinktion in Verbindung zu unserem Stoff, dessen Konzentration und der Schichtdicke des optischen Mediums dar. Die Schichtdicke ist sozusagen die Breite der Küvette, die in der Regel auf 1 cm genormt ist. Bleibt nun also die Schichtdicke konstant, sowie der molare, dekadische Extinktionskoeffizient (Verschluckung der entsprechenden Wellenlänge), so gibt es hier eine lineare Funktion. Diese Gerade steigt mit steigender Konzentration der Probe in der Lösung.

Somit kann die Konzentration des gesuchten Stoffes ermittelt werden. Beachten Sie: Das Lambert-Beer'sche Gesetz gilt nur bei geringen Konzentrationen des "Farbstoffes". Somit gibt es eine natürliche Obergrenze für die Extinktion. Als Beispiel nehemn wir an unsere Lösung sei vollständig schwarz, es kommt dann kein Licht mehr durch. Gibt man mehr Farbstoff hinzu, steigt zwar die Konzentration, aber es kommt sowieso kein Licht zum Messen mehr durch die Lösung.

Es gibt in der Realität kein Material, das das Lambertsche Gesetz exakt erfüllt. Insbesondere hat die Strahldichte jeder Oberfläche eine Richtungsabhängigkeit und diese verändert sich, wenn sich die Richtung ändert, aus der die Oberfläche beleuchtet wird. Selbst Normale, die zur Kalibrierung von Messgeräten eingesetzt werden, lassen sich nur in bestimmten Reflexionsrichtungen und Wellenlängenbereichen gut durch das Lambertsche Gesetz beschreiben. Bei Wellenlängen außerhalb des sichtbaren Spektralbereichs und bei Reflexions- bzw. Beleuchtungsrichtungen von mehr als einigen 10° zur Senkrechten können selbst bei Normalen Abweichungen von mehreren 100 % zum Lambertschen Gesetz auftreten. [1]

Erstellung eines Spektrums mit einem Photometer

In der Regel reicht es zur Konzentrationsbestimmung eines Analyten in der Probe die Extinktion oder die Absorption der Lösung zu messen. Möchte man aber seinen Analyten genauer charakterisieren, kann es sein, dass man ein Spektrum aufnehmen muss.

In der Regel wird hierfür bei jeder Wellenlänge einzeln die Extinktion bei festgelegter Konzentration und Schichtdicke gemessen. Da man aber nicht für jede Wellenlänge eine Kallibrierung vornehmen möchte, werden heute moderne Spektrometer verwendet, die diese Aufgabe selbständig übernehmen. Die Spektralanalyse ist ein wichtiges Verfahren zur Identifikation und/oder Konzentrationsbestimmung unbekannter Substanzen.

UV/VIS-Spektroskopie

Wenn wir von Spektren Reden, bewegen wir uns nicht mehr in der Photometrie, sondern in der Spektroskopie oder genauer gesagt, der UV/VIS-Spektroskopie. Der Name rührt daher, dass diese Spektren vom UV- (Ultra Violet) bis zum sichtbaren (Visible) Bereich des Lichtes aufgenommen werden.

UV/VIS-Spektroskopie beruht auf Messung der Extinktion von sichtbaren und ultravioletten Licht durch die Probe. Die spektrale, d. h. wellenlängenabhängige, Information kann entweder durch Selektion und Scannen der Wellenlänge des einfallenden Lichts vor der Probe (siehe Zweistrahl-Spektrometer) oder durch Trennen der Wellenlängen des transmittierten Lichts nach der Probe (Diodenarray-Spektrometer) gewonnen werden. Das Verhältnis der spektralen Intensität des transmittierten und des einfallenden Lichts liefert das Transmissionspektrum. Der logarithmische Kehrwert der Transmission ergibt das Extinktionsspektrum.

Grundsätzlich liefert die Extinktion Informationen über die Absorption, Streuung, Beugung und Reflexion an und in der Probe. Häufig werden in der UV/VIS-Spektroskopie Erscheinungen der Strahlungsabsorption ausgewertet, da die Photonenenergie des sichtbaren und ultravioletten Lichts der Übergangsenergie der Zustände von äußeren Elektronen vieler Atome und Moleküle entspricht. Durch Absorption von Photonen im sichtbaren und ultravioletten Spektralbereich können Valenzelektronen (beispielsweise die der p- und d-Orbitale) angeregt werden, das heißt, in einen Zustand höherer Energie übergehen. Das Transmissions- oder Extinktionsspektrum erlaubt daher die Identifikation und quantitative Bestimmung von Analyten. 

Hier eine Übersicht von Spektralphotometern und HowTo's.

[1]  Andreas Höpe, Kai-Olaf Hauer: Three-dimensional appearance characterization of diffuse standard reflection materials. In: Metrologia. Band 47, Nr. 3, April 2010, S. 295–304, doi:10.1088/0026-1394/47/3/021.